传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

本试验首先用PCR方法扩增出ILTVgB基因 ,将其克隆到质粒pUC1 1 9中 ,并进行了序列分析。将克隆的gB基因再亚克隆到禽痘病毒转移载体质粒中 ,然后 ,通过质脂体方法转染由禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中 ,筛选蓝色的重组病毒 ,并对其进行了 6轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明其基因组中含有完整的鸡传染性喉气管炎gB基因 。

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

将新城疫病毒 (NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒 (FPV)插入载体 pFG1175 1的P7 5启动子下游 ,得到转移载体pFG1175 1重组质粒。采用脂质体转染技术 ,将该质粒转染FPV2 82E4株感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。经过多次蓝斑筛选纯化 ,获稳定的重组病毒rFPV NDF。间接免疫荧光试验表明 ,rFPV NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV NDF免疫的SPF试验鸡能产生对NDV强毒攻击的免疫力 ,保护率达96 3%。

共表达H_9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒 (流感 )的基因工程疫苗 ,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素 (HA)基因、鸡Ⅱ型干扰素 (IFN Ⅱ )全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子 (PE/L)的基因片段 ,定向插入鸡痘病毒转移载体 1175的痘苗病毒启动子P7.5的下游 ,得到HA和IFN Ⅱ基因分别处于P7.5及PE/L转录调控下的重组转移载体 1175HAIFN。以脂质体转染法将 1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株 (wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。 1175HAIFN与wt FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV HA IFN Ⅱ。通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rF PV HA IFN Ⅱ。以间接免疫荧光法和细胞病变抑制试验证实 ,纯化的rFPV HA IFN Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗VSV活性的鸡IFN Ⅱ。动物试验表明 ,rFPV HA IFN Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后 1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒 ,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒 (rFPV HA)抑制 1日龄SPF雏鸡增重的副作用。

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒对SPF鸡的免疫保护作用

将表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IBVS1)以5×106PFU剂量翅皮下注射接种4周龄的SPF鸡。血清抗体检测表明,该重组鸡痘病毒能刺激鸡体产生特异性抗体,外周血液中CD4+、TCRγδ+T淋巴细胞比例显著高于对照组,而CD8+T淋巴细胞比例低于对照组。免疫后4周用1×103.0EID50的传染性支气管炎病毒LX4株进行攻毒,结果表明,重组鸡痘病毒免疫组与IB弱毒疫苗免疫保护率分别为12/16和13/16;攻毒后喉拭子IBV分离结果表明,IB弱毒疫苗和重组鸡痘病毒免疫组的IBV气管排毒时间比对照组缩短了2 d,病毒的分离率显著低于对照组;肾脏、气管、肺脏、腺胃、脾和肝脏的病理损伤也较对照组轻,而且病变持续时间缩短。

鸡痘病毒载体强启动子的构建和筛选

根据痘苗病毒天然启动子Ｐ７．５关键区的结构，人工合成４条寡核苷酸，形成早、晚期启动子，把合成的启动子进行不同组合，得到１０个较有代表性的不同启动子组合ＰＳ１～１０，用Ｐ７．５作对照构建成表达ＬａｃＺ基因的表达载体ｐＦＢＳ１～１０以及ｐＦＢＳ７．５．利用脂质体介导转染鸡痘病毒中国疫苗株２８２Ｅ４，获取重组病毒，经纯化后，分别测重组病毒感染次代ＣＥＦ后１０、２４、３６、４８、７２ｈ表达β半乳糖苷酶的活性，从而筛选出其中最强的启动子组合ＬＬＥＥ，其ＬａｃＺ基因的表达活性约为Ｐ７．５的３倍。

中国疫苗株鸡痘病毒插入载体的构建与MDV糖蛋白B的表达

在对中国鸡痘病毒疫苗株２８２Ｅ４基因组ＤＮＡ进行克隆与亚克隆的基础上，进一步插入Ｐｌｌ一ＬａｃＺ标记基因，根据蓝斑选择原理筛选出３个为病毒在细胞培养物上生长所不必需的片段。为了便于外源基因的插入，特将Ｐ７．５一Ｐｌｌ一ＬａｃＺ基因框转移至ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＳＫＭ１３一的ＢｄｍＨＩ位点，在Ｐ７．５下导人多克隆位点（ＭＣＳ），建立了载体插入标记ｐＳＧＭ１１７５。以ＳｓｔＩＩ和ＡｐａＩ将ＭＣＳ一Ｐ７．５一Ｐｌｌ一ＬａｃＺ框切下，置入一个亚充隆的非必需片段中，构建成中国鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５一１。以ＰｓｔＩ和ＳｍａＩ酶切ｐＶＬｇＢ分离ＭＤＶｇＢ基因的开放阅读框，并将其插入ｐＦＧ１１７５中Ｐ７．５的下游，得到携带ｇＢ基因的质粒ｐＦＧＢ１１７５一１。将此质粒以脂质体转染２８２Ｅ４株感染３一４小时的鸡胚成纤维细胞，同样采用蓝斑筛选技术得到重组的蓝斑病毒。以ＭＤＶｇＢ单克隆抗体进行间接免疫荧光，证实了感染细胞中ｇＢ抗原的存在，从而成功地建立了可表达ＭＤＶｇＢ糖蛋白的以中国疫苗株为基础的重组鸡痘病毒。

鸡痘病毒PCR检测方法的建立

根据已发表的鸡痘病毒 (fowlpox virus,FPV) 4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了 2对引物 ,通过对影响PCR扩增因素的优化 ,2对引物在同一反应条件下 ,以抽提 FPV DNA或直接用其毒液制备的模板均能分别扩增出预期的 5 4 9、136 1bp的片段。特异性检测表明 ,2对引物对 FPV10 2株、FPV2 82 E4 (北京 )、FPV2 82 E4 (吉林 )、v FV2 82重组鸡痘疫苗毒及 FPV临床分离株均能扩增出相应特异性片段 ,而用鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、羊痘病毒、鸡胚成纤维细胞 (CEF)制备的模板分别进行 PCR扩增却成阴性。敏感性检测表明 ,2对引物 (p1 ,2 、g1 ,2 )分别能检测到 10 - 2 、10 - 3fmol的 FPV DNA和 10 0 .5、10 - 0 .5TCID50 的病毒。以上结果表明 ,本试验所建立的 FPV PCR检测法具有较高的特异性和敏感性 ,模板制作简单 ,完全可用于

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒 (rFPV -ILTVgB)的稳定性 ,我们对重组病毒进行 6代和 16代克隆纯化 ,对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传 2 0代。结果发现第 6代纯化病毒 (rFPV -ILTVgB -C6)在传代过程中有白斑出现 ,说明病毒纯度不够 ;经过 16代纯化的病毒 (rFPV -ILTVgB -C16)对细胞的嗜性加强 ,病毒的效价进一步升高 ,2 0代传代后蓝斑率仍然为 10 0 % ,PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第 5 ,10 ,15 ,2 0代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种 2周龄SPF鸡 ,2 0天后分为两组 ,分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒 10 2株攻击 ,结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击。鸡体内病毒传代试验表明 ,重组病毒在接种部位仅存在 6天 ,之后就检测不到病毒 ,重组病毒通过SPF鸡连续传代 ,不存在病毒返祖的可能。由此可以得出一个结论 ,rFPV -ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的 ,无论是在体外传代 ,还是在体内均可以稳定遗传 ,不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能 ,完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定

将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV_ILTVgB)通过鸡胚成纤维细胞培养 ,加入适当的保护剂制成冻干疫苗。取 3批冻干疫苗 ,生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种 14日龄和 5 0日龄SPF鸡 ,接种剂量为 5× 10 6 PFU ,接种后 3天出现局部反应 ,5天局部肿胀达到最大 ,接种鸡无其它全身反应 ,精神、食欲以及发育等均不受影响 ,说明重组病毒对试验鸡是安全的。取其中的 2 0 0 0 0 3批疫苗 ,用生理盐水作 2 10 -2 ～ 2 10 -5稀释后 ,翅内侧无血管处皮下接种 4 0日龄SPF鸡 ,免疫后 4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒 10 2株 ,结果表明 ,重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力 ,在接种剂量为 2 10 -2 ～ 2 10 -40 .1ml/鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应 ,当接种剂量为 2 10 -50 .2ml/鸡时可以使部分试验鸡 ( 5 /15 )产生局部反应 ,鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为 2 10 -40 .1ml(相当于 10 0 0PFU)。攻毒试验结果进一步证明 ,当接种剂量为 2 10 -40 .1ml(相当于 10 0 0PFU)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力 ,抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒 10 2株的攻击 ,降低鸡群的发病率和病死率。这些结果说明 。

鸡痘病毒282E4株表达载体的构建及新城疫病毒F蛋白的表达

将鸡痘病毒 2 82 E4株 TK基因和 1 .5kb B片段 2个非必需区克隆后 ,分别在 TK基因 Nco 位点和 B片段 Eco R 位点插入复合启动子 (由牛痘病毒 A型包涵体启动子和 2 0个串联的痘苗病毒 ( VV)突变型 p7.5早期启动子串联组成 ) ,然后在复合启动子上游插入单一启动子 (人工合成的由 1 6个串联的 VV突变型p7.5早期启动子组成 )调控的 Lac Z基因或 GFP基因作为报告基因 ,构建成分别以 TK基因或 B片段为侧翼、以复合启动子调控目的基因的 2个以 Lac Z为报告基因的表达载体 p UTA-2 -1 6Lac Z和 p UBA-7-1 6Lac Z,2个以 GFP为报告基因的表达载体 p UTA-2 -F71 6和 p UBA-7-F71 6。在 TK基因 Nco 位点和 B片段 Eco R 位点插入单一启动子和单一启动子调控的 Lac Z基因 ,得到 2个分别以 TK基因或 B片段为侧翼、以单一启动子调控目的基因、以 Lac Z为报告基因的表达载体 p UT1 61 6Lac Z和 p UB1 61 6Lac Z。将构建的 6个表达载体分别转染 FPV HIPRA株感染的鸡胚成纤维 ( CEF)细胞 ,仅在转染以 TK基因为侧翼、以 Lac Z为报告基因的 2个表达载体 p UTA-2 -1 6Lac Z和 p UT1 61 6Lac Z收获的病毒中 ,在 X-gal存在下 ,筛选出了表达 Lac Z的蓝色重组病毒蚀斑 ,而转染以 B片段为侧翼的表达载体在同样条件下未筛选到蓝色病?

鸡痘病毒弱毒疫苗株在鸡组织内的分布、消长规律及毒性试验

通过两侧翅内侧皮肤无血管处刺种和滴鼻、点眼等途径给10日龄商品蛋公鸡接种鸡痘病毒(FPV)弱毒疫苗株,利用PCR的方法检测其在鸡体内的分布与消长规律并对其毒性进行了研究。刺种组:接种后6 h在刺种部位皮肤即可检测到病毒DNA;接种后1 d,皮肤、肺、脑PCR检测阳性;7 d,在皮肤、肺、脑、心、脾、肾、法氏囊均可检测到病毒DNA,肝为疑似;10、15 d,肝为阳性;21 d,脾、法氏囊PCR检测为阴性,肝为疑似;28 d,除刺种部位皮肤外所有内脏器官中均未检测到病毒DNA,但刺种部位皮肤一直到接种后35 d仍可检测到病毒DNA。而对照组在整个试验期间PCR检测均为阴性。滴鼻点眼组:基本规律与刺种组相同。接种后3 h,在肺部即可检测到病毒DNA;6 h,在肺和脑部PCR检测成阳性,法氏囊为疑似;1 d,在肺、脑、心、脾、肾、法氏囊均可检测到病毒DNA,肝为疑似;21 d,肺、肾、法氏囊、脑均为阳性,其中脑一直持续到接种后28 d。而对照组在整个试验期间PCR检测均为阴性。毒性试验表明,FPV弱毒疫苗株虽使用安全但通过翅内侧皮肤无血管处大量刺种存在导致全身皮肤感染出痘的危险。

抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病。在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件。在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护。在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体。这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播。

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力

以鹅源H5亚型禽流感病毒 (AIV)基因组为模板 ,用RT PCR扩增血凝素 (Hemaggluti nin ,HA)基因 ,克隆入鸡痘病毒表达载体pFG1 1 75 ,转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞 ,通过蓝斑筛选和间接免疫荧光检测 ,获得表达HA基因的重组鸡痘病毒 (Recombinantfowlpoxvir us,rFPV HA)。rFPV HA经鸡胚成纤维细胞连续传 1 5代后 ,报告基因LacZ和HA基因可稳定表达。用 1 0 3PFU和 1 0 5PFU的rFPV HA免疫无特定病原体的 (Specificpathogenfree,SPF)鸡 ,免疫后 2 2d血凝抑制 (Hemagglutinininhibition ,HI)抗体监测阳性率分别为 0 %和 2 0 % ,但均抵御了H5亚型毒株的致死性攻击 ,保护率为 1 0 0 %。结果表明 ,构建了表达HA基因的重组鸡痘病毒 ,该重组病毒具有良好遗传稳定性 ,免疫鸡可提供完全保护 ,显示出了一定的应用前景。

表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RT PCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒 (AIV)分离株 (A Chicken China F 1 998)的血凝素 (HA)基因 ,将其定向插入鸡痘病毒转移载体 1 1 75的痘苗病毒启动子P7 5的下游 ,得到重组转移载体 1 1 75HA。以脂质体转染法将 1 1 75HA转染至已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株(wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中 ,通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV HA。以间接免疫荧光法证实感染rFPV HA的CEF表达了HA。rFPV HA在免疫 7日龄SPF鸡 7天后即能诱生可检出的血凝抑制 (HI)抗体 ,1 4天后诱生的HI抗体到达高峰 ,且诱生的HI抗体保持较高水平达 5 5天。在 7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明 ,rFPV HV能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒 ,效果与AIV全病毒灭活苗相当。

利用BrdU在CEF(TK^+)细胞中筛选TK^-重组鸡痘病毒

将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK+)细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的

表达鸡γ-干扰素和传染性支气管病毒S1基因的重组鸡痘病毒疫苗对鸡外周血T淋巴细胞动态分布影响的研究

机体的免疫应答是一个复杂的生物学过程,它以体液和细胞免疫为主,二者相互影响,相互作用,而构成了一个动态整体。本研究通过FACS技术检测SPF鸡接种共表达IBVS1基因和鸡γ-干扰素基因的重组鸡痘病毒疫苗后外周血中CD4+、CD8+和TCRδγ+三种亚类T淋巴细胞的数量的变化,初步探讨了干扰素对鸡外周血中T淋巴细胞亚类动态分布的影响。结果表明,含有干扰素基因的重组鸡痘病毒能显著增高机体特异性的CD8+和TCRδγ+T淋巴细胞水平,CD4+T淋巴细胞比例则要低于其他的疫苗免疫组。

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的免疫效力

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡,通过比较免疫后血凝抑制(HI)抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标评价其免疫保护作用。免疫后21d,重组鸡痘病毒免疫组仅有13%～20%鸡的HI抗体检测呈阳性。在同亚型禽流感病毒攻击后,重组鸡痘病毒疫苗免疫组产生了100%的保护率,而未免疫组全部死亡。结果表明:重组鸡痘病毒疫苗不能激发高滴度HI抗体应答,但可抵御同亚型禽流感病毒致死性攻击,保护效果达到或优于目前应用的灭活苗,显示出良好的应用前景。

鸡痘病毒复制非必需区的选择对重组鸡痘病毒免疫效力的影响

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体疫苗至今未能得到大规模推广应用的主要原因,而选择适当的FPV复制非必需区可能是解决这一问题的方法之一。根据已发表的美国致病株FPV的基因组设计两对引物,用PCR方法扩增FPV假定复制非必需区的两个侧翼区FPV1和FPV2 ,利用此假定复制非必需区构建FPV表达载体pP12LS及表达ZJ1株新城疫病毒(NDV)F基因的转移载体pP12LSF。pP12LSF与2 82E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF) ,经数轮蓝斑筛选得到纯化的重组病毒rFPV_FSC。重组FPV在CEF上连续传2 0代仍具有良好的遗传稳定性。对重组FPV进行免疫效力试验,在SPF鸡上,重组病毒rFPV_FSC和与之仅有复制非必需区差异的rFPV_FSB均能抵抗NDV强毒的攻击,提供10 0 %的保护。但在有母源抗体的商品鸡上,rFPV_FSC与rFPV_FSB的免疫效力却有显著差异,保护率分别为10 0 %和6 1 5 4 % ,rFPV_FSC的免疫效力与NDV常规油苗相当。试验结果表明,母源抗体对重组FPV的免疫效力有一定的影响。

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。用ILTVWG株和FPV102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫。其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTVWG株和FPV102株攻击也获得了完全保护。

鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡II型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

将鸡II型干扰素(ChIFNγ)基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插入到鸡痘病毒转移载体中,构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY-ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经过8轮蓝斑筛选,得到纯化的能够同时表达鸡II型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγS1。rFPV-ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后,可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体,重组病毒接种鸡的CD4+、CD8+和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡(P<0.05);免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击,rFPV-ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状(1/16),而非免疫对照组则有16只发病(16/16),并有2只出现死亡(2/16),表明rFPV-ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。