鸡白痢/禽伤寒沙门菌抗体检测试剂的比较与评估

对市面上现有鸡白痢／禽伤寒沙门菌抗体平板凝集检测试剂及其不同批次，微量凝集检测试剂和ELISA共4种检测试剂进行比较与评估。用4种试剂以及试剂A的不同批次检测来自11个种鸡场的1650份血清，计算不同试剂检测种鸡场的抗体阳性率，2种试剂之间的阳性符合率、阴性符合率和总符合率，并以Kappa检验判断不同检测方法及其试剂之间的一致性程度。平板凝集试剂A的不同批次间以及平板凝集试剂A和B之间具有高度一致性（Kappa系数-0．714～0．746），但阳性符合率不足80％。平板凝集试剂A、微量凝集试剂C、ELISA试剂D之间仅具有中度或弱一致性（Kappa系数-0．392～0．542）。不同鸡白痢／禽伤寒沙门菌抗体检测试剂间存在差异，平板凝集试剂不同批次间也存在差异，提示试剂生产厂家应加强质量控制，同时研发敏感性、特异性、稳定性更好的替代试剂，而种鸡场在进行抗体监测时应固定使用1种检测试剂，避免影响检测结果的准确性和连续性。

基于pegB基因的鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别方法的建立

为建立一种能快速、准确、简便区分鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的方法,研究通过对鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌pegB序列进行分析,发现存在3个单核苷酸多态性位点,基于此建立了一种特异性PCR方法用于鉴别鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌。结果显示,该方法特异性强、耗时短,检测限为10.14 pg/反应。临床样品检测表明,该方法不仅具有良好的特异性,且操作比传统方法更为简便。该方法的建立为准确区分鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌提供了实用技术,将在分子检测中发挥重要作用。

鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的PCR-RFLP分子鉴别

根据鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌fliC基因可变区两端的保守序列设计1对引物,PCR扩增出约600bp的产物,用Hin6I对PCR产物进行酶切,经RFLP分析区分鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌的生物型。利用该技术对6株鸡白痢沙门氏菌标准株及2株鸡伤寒沙门氏菌标准株进行分子鉴别,得到的结果与预计的RFLP模式相符,证明该方法可行。在此基础上对我国不同地区、不同年代的191株鸡沙门氏菌进行分子鉴别,191株中有185株分离株符合鸡白痢沙门氏菌的RFLP模式,6株分离株符合鸡伤寒沙门氏菌的RFLP模式,其中有176株PCR-RFLP鉴定结果与生化特性符合率达100%,另有15株根据生化特性不能鉴别。

复方白头翁散抑制鸡白痢沙门菌生物被膜形成的初步研究

为探讨复方白头翁散防治鸡白痢沙门菌的效果,并研究其抑制细菌生物被膜的机制。从临床样品中分离出鸡白痢沙门菌,对其进行药敏试验,测定其生物被膜的形成能力。体外试验中,检测复方白头翁散对分离菌株的最小杀菌浓度(MBC)、生物被膜的抑制效果、抑制细菌黏附、侵袭效果以及对相关基因sipC、rpoS、rcsC、invA、hilA、csgB、bcsA和pagC表达水平的影响。结果表明:从临床样品中分离出10株鸡白痢沙门菌,这些菌株至少对1种抗生素耐药,多重耐药率为30%,最高为5重耐药;90%分离株可形成生物被膜。复方白头翁散对9株细菌的最小杀菌浓度为62.5 mg·mL^(-1);该药可在1/2 MBC浓度使分离株黏附率下降93%,侵袭率下降36%,在1/4 MBC浓度使黏附率下降87%,但使侵袭率升高;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析发现,复方白头翁散下调鸡白痢沙门菌sipC基因表达量,上调其invA、bcsA和pagC等基因表达量。这一研究说明通过调节相关基因的表达水平,复方白头翁散抑制鸡白痢沙门菌生物被膜形成,从而阻止其感染。

鸡沙门氏菌病及综合防控措施

鸡沙门氏菌病是由沙门氏菌引发的一种高发的传染性疾病,该病菌属于条件性致病菌,可以感染攻击不同日龄的鸡群,降低病鸡的身体机能水平,影响养殖效益。鸡沙门氏菌病主要有三种类型,即鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒,其发病症状及病理表现有一定差别。本文重点介绍鸡沙门氏菌病的症状与病变特征、传播方式及综合防制措施。

鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌PCR-RFLP鉴别

根据鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌flic基因可变区两端的保守序列设计1对引物,PCR扩增出约866 bp的产物,用Hinp1I对PCR产物进行酶切,经RFLP分析区分鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌。利用该技术对1株鸡白痢沙门菌标准株及2株鸡伤寒沙门菌标准株进行分子鉴别,结果与预计的RFLP模式相符,证明该方法可行。在此基础上对分离株进行鉴别,证明分离株均属于鸡白痢沙门菌。

江西地方品种鸡禽白血病病毒及鸡白痢沙门氏菌感染状况的研究

禽白血病毒(ALV)和鸡白痢沙门氏菌(SP)均可以垂直传播。通过禽白血病病毒(ALV)J亚群抗体和群特异性P27抗原的商品化ELISA检测试剂盒和全血平板法等调查了江西省13个种鸡企业的8个地方品种鸡群ALV和SP的感染情况,结果显示:ALV-P27抗原、ALV-J抗体均有检出,江西省地方鸡ALV-J亚型感染相当严重,迫切需要净化。江西地方品种鸡白痢沙门氏菌感染率相差较大,同一品种鸡在不同场之间的SP感染率差异明显。生物安全措施会影响鸡白痢的感染情况,在鸡白痢的净化过程中,采取严格的淘汰制度的同时,必须加强饲养管理措施来控制鸡白痢的发生。

鸡伤寒白痢沙门氏菌灭活菌苗的研制

由鸡沙门氏菌株 C79-1 3和 C79-2 0及新疆分离株 AS97-1 9和 AS96-4四株菌 ,经自制的改良硫代硫酸钠培养基 ,通气搅拌培养 ,甲醛灭活制成氢氧化铝佐剂苗 ,经免疫接种健康鸡。免疫后 2 1 d抗体水平达到最高 ,经 ANAE方法和 T淋巴细胞 E花环方法检测 ,免疫组的细胞免疫水平明显高于非免疫对照组 ,差异极显著 ,1 0 LD剂量强毒株攻菌试验 ,死亡保护率达 94 .7%,免疫组分离菌率为 3 .1 %,表明该苗具有良好的安全性和免疫效果。

鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。

鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的验证

为验证鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的准确性,本研究以3株鸡白痢、鸡伤寒沙门菌国际参考菌株和306株国内分离株为研究对象,采用5种已知的分子分型方法开展验证性实验。结果发现,基于特定基因可变区的2种分型方法具有良好的特异性,其检测结果与生化分型结果一致,而3种基于特定基因单核苷酸多态性的分型方法则出现假阳性或假阴性的结果。上述结果表明,鸡白痢、鸡伤寒沙门菌分子分型方法的准确性仍需进一步验证。

鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌基因组消减文库的构建

为了解鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的基因组差别,筛选鸡白痢沙门氏菌特有的序列,利用SSH对鸡白痢沙门氏菌C79-13(实验方)与鸡伤寒沙门氏菌Sg9(驱动方)基因组进行了比较。选择四碱基内切酶Rsa I将C79-13与Sg9基因组DNA酶切,酶切的C79-13基因组DNA分成两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR,得到消减混合物,将其与PCR 2.1克隆载体连接,转化感受态E.coli DH5α建立消减文库。结果共获得400个阳性克隆;筛选240个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2000 bp大小的片段。差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆鸡白痢沙门氏菌特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。

鸡伤寒白痢沙门氏菌培养基和培养方法的研究

本试验用 5种培养基对鸡伤寒白痢沙门氏菌 (Sgp)菌株C79_2 0和AS96_1进行了静止培养对比试验 ,结果表明 ,改良硫代硫酸钠培养基和EEM培养基为最适合Sgp的培养基 ,硫代硫酸钠培养基次之 ,普通营养琼脂和SBG琼脂最差 ;对C79_13菌株用改良硫代硫酸钠培养基进行了通气搅拌培养、静止厌氧培养和静止需氧培养的对比试验及pH值对细菌生长的影响试验 ,结果表明 ,通气搅拌培养方法明显优于其它两种培养方法 ,调整pH的试验组菌悬液的OD值和菌数明显高于不调整pH值的试验组。

cya/crp基因缺失对鸡白痢沙门菌生物学特性影响的研究

为了解crp/cya基因对鸡白痢沙门菌毒力和生物学特性的影响,本研究构建缺失1182 bp cya基因的重组自杀性质粒pREΔcya,并经酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌χ7213作为供体菌,分别以鸡白痢沙门菌C79-13株和本研究室前期构建的其crp基因缺失株C79-13Δcrp(简写为Δcrp)为受体菌,利用重组自杀性质粒介导的同源重组技术构建C79-13菌株的单基因缺失株Δcya以及双基因缺失株ΔcrpΔcya,并均经PCR和测序鉴定。将这3株菌连续传60代后每隔10代分别利用PCR鉴定cya基因缺失的遗传稳定性;利用玻片凝集试验鉴定各菌株的血清型,并鉴定各菌株的生化反应特性;绘制各菌株的生长曲线分析缺失株与亲本株的生长特性;通过微量结晶紫法检测各菌株的生物被膜(BF)形成能力。PCR和测序鉴定结果显示Δcya、ΔcrpΔcya均正确构建,且cya基因缺失均具有稳定的遗传性。血清型及生化鉴定结果显示,菌株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya均保留了C79-13的O9血清型,而失去了发酵蔗糖、鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖等糖类的能力。生长曲线及BF形成能力的检测结果显示,各缺失株的生长速度较亲本株相比均显著降低,尤其双基因缺失株ΔcrpΔcya的生长速度极显著下降(P<0.01),且基因缺失株BF的形成能力均极显著降低(P<0.01),其中双基因缺失株BF的形成能力更低。将3株缺失菌及亲本菌分别以不同的剂量(5×10^(8)cfu/只~7×10^(11)cfu/只)经腹腔注射感染雏鸡进行毒力试验,计算各菌株对雏鸡的半数致死量(LD_(50))。将各缺失株以10^(7) cfu/mL两次经灌服免疫雏鸡,100μL/只,二免后7 d各组雏鸡均以5.0×10^(8)cfu/mL经腹腔注射亲本菌株C79-13进行攻毒试验,500μL/只,在42 d的观察期内观察并记录各组鸡的发病及死亡情况,计算各基因缺失株对雏鸡的免疫保护率。结果显示,缺失株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya对雏鸡的LD_(50)分别为2.84×10^(9) cfu/mL、1.41×10^(10)cfu/mL、2.51×10^(11)cfu/mL,与亲本菌株C79-13相比,各缺失株LD_(50)分别升高约1.1×10^(3)倍、5.7×10^(3)倍、1.0×10^(5)倍;各组雏鸡攻毒后出现精神沉郁症状,且有部分鸡死亡,PBS对照组鸡出现排稀便症状,且全部死亡。Δcya、Δcrp及ΔcrpΔcya对雏鸡的免疫保护率分别为60%、80%、50%。表明各基因缺失株均能够对雏鸡提供一定的免疫保护效果,且单基因缺失株Δcrp的免疫效果最好。本研究首次对鸡白痢沙门菌crp、cya基因生物学功能做了初步研究,并证实缺失株Δcrp有望作为一种鸡白痢沙门菌基因缺失疫苗的候选菌株,为研制安全有效的沙门菌弱毒活疫苗奠定了基础。

复方中草药“毒菌杀”对禽大肠杆菌及鸡白痢沙门氏菌的体外抑菌试验

观察了复方中草药“毒菌杀”的安全性及其对禽大肠杆菌及鸡白痢沙门氏菌的体外抑菌情况。结果发现“毒菌杀”安全性高,组成“毒菌杀”的各单味中药及其合剂对大肠杆菌的最低抑菌浓度MIC(g/mL)分别为板蓝根0.05、穿心莲0.05、黄芪0.025、黄柏0.05、柴胡0.05、生地0.05、甘草0.05、当归0.025,“毒菌杀”方剂为0.05;对沙门氏菌的MIC分别为板蓝根0.05、穿心莲0.025、黄芪0.025、黄柏0.05、柴胡0.025、生地0.05、甘草0.025、当归0.05,“毒菌杀”方剂为0.025;而牛胆汁对这两种致病菌的最低抑菌浓度分别为2%和1%。说明“毒菌杀”方剂对大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑制作用。

鸡白痢沙门菌pagC基因缺失株菌蜕疫苗的制备和免疫保护效果评价

为了在鸡白痢沙门菌pagC基因缺失突变株的基础上制备可用于鉴别诊断的菌蜕疫苗并评价其免疫保护效果,本研究利用细胞穿膜肽MAP制备ΔPagC菌蜕,透射电镜和荧光显微镜观察菌蜕形态和核酸残留情况;将ΔPagC菌蜕与佐剂ISA206混合乳化制备菌蜕疫苗并进行无菌检测;基于ICR小鼠评价菌蜕疫苗对鸡白痢沙门菌CVCC1800、肠炎沙门菌ATCC19585和鼠伤寒沙门菌CVCC542感染的交叉保护效果;结合基于PagC蛋白的沙门菌血清学检测方法评价pagC基因缺失株菌蜕疫苗的鉴别诊断效果。结果显示,菌蜕制备最佳条件为用终浓度为50μmol/L MAP溶液处理OD_(600 nm)=0.3的菌液1 h以上,灭活效果可达99.00%;菌蜕保持基本细胞形态的同时内容物大量释出,核酸残留水平较低;菌蜕疫苗针对上述3种血清型沙门菌的免疫保护率分别为25%、100%和100%;菌蜕疫苗与基于PagC蛋白的沙门菌血清学检测方法联用可在一定程度上起到鉴别诊断作用。结果表明,制备所得菌蜕疫苗在保护小鼠的同时,能够在一定程度上区分人工免疫和自然感染,为沙门菌的净化工作提供帮助。

雏鸡感染鸡白痢沙门菌后禽β-防御素6和鸡Toll样受体15在肠道转录与定位研究

旨在分析雏鸡感染鸡白痢沙门菌后,禽β-防御素6(AvBD6)和鸡Toll样受体15(ChTLR15)在小肠内的分布及表达规律。本研究用鸡白痢沙门菌感染14日龄的雏鸡,感染后不同时间点采取雏鸡的小肠组织(十二指肠、空肠和回肠),利用实时荧光定量RT-PCR和原位杂交方法,检测AvBD6和ChTLR15在小肠组织内的定位和mRNA的转录水平变化。结果显示,雏鸡感染鸡白痢沙门菌后,AvBD6和ChTLR15在各肠段组织中均有转录,其中在十二指肠相对转录量最高,在0~24h内呈上升趋势,24~48h相对转录量呈下降趋势,在24h的转录量极显著高于0和6h(P<0.01),且AvBD6在24h的转录量显著高于12h(P<0.05)。AvBD6和ChTLR15mRNA在小肠内均有不同程度的分布,其主要分布在肠绒毛的中央乳糜管中,在十二指肠中荧光信号最强。结果表明,雏鸡感染鸡白痢沙门菌后,AvBD6和ChTLR15mRNA在鸡小肠中的分布和表达具有一定的规律性,并参与肠道免疫调节功能。

新疆地区鸡伤寒白痢沙门氏菌病的调查

对新疆地区鸡沙门氏菌病进行了病原学、血清学和流行病学调查 ,结果表明分离的 2 46株细菌与鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌诊断血清呈阳性反应 ;对 15株鸡沙门氏菌进行抗原结构分析 ,表明 8株为标准型鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌 ,7株为中间型鸡沙门氏菌 ;对其中 86株菌的生化鉴定表明符合鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌的生化特性。该病在我区的发病死亡率为 1%～2 5 % ,发病严重的鸡场为 5 0 %～ 75 %。该病除了单一感染外 ,还与鸡大肠杆菌、葡萄球菌、鸡球虫病混合感染。

新型凝集技术快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门菌

为探求鸡白痢、鸡伤寒沙门菌快速检测的新型凝集技术，尝试用3种有机活性染料与抗体分别修饰二氧化硅活性微球制成免疫彩色二氧化硅微球（ICSN），构建快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门菌新型凝集技术。利用反相微乳法制备彩色二氧化硅纳米微球（CSN），用扫描电镜表征形貌特征和分散程度，通过凝集现象表征对鸡白痢、鸡伤寒沙门菌的检测效果。结果表明该新型凝集技术灵敏度好，其凝集结果醒目、直观、易于肉眼判别，且耗用抗体不到常规凝集试验的1／500，对目标菌的检测范围为10^2～10^9cfu·mL-1；重复性和稳定性好，4℃放置28d后，凝集效果与放置前无显著差异；具有较好的特异性和准确性。用ICSN构建的新型凝集技术具有灵敏、经济、稳定、简便、快速、准确等优点，不仅适用于快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门菌，还可为其它致病微生物快速检测提供基础模型。

电化学共沉积石墨烯纳米金鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌新型免疫传感器

为研制一种新型快速检测鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的方法,本研究采用电化学还原法,将石墨烯(ERGO)与纳米金(AuNPs)共沉积修饰于丝网印刷碳电极表面,建成电学和生物学相容性显著改进的ERGO-AuNPs电极,结合双抗体夹心法,构建快速检测鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的酶免疫传感器。以硫堇为分子探针采用循环伏安法(CV)和交流阻抗谱法(EIS)检测不同修饰电极的电化学特性。结果显示,在优化的测定条件下,该传感器对目标菌的检测线性范围为103cfu/mL^109cfu/mL,检测限为1.18×102cfu/mL(S/N=3)。石墨烯和纳米金共沉积形成的复合膜能够显著提高电极表面电子传递能力,增大电流响应信号,增强了酶免疫传感器的灵敏度、特异性和稳定性(4℃放置30 d后,响应电流为初始值的97.14%)。不仅可以检测鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌,还可以成为研究快速检测其它致病微生物及毒素等各类抗原物质免疫传感器的基础模型。