鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因是新近被确定的非哺乳类IL 2基因。将鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因和传染性法氏囊病病毒 (IBDV)多聚蛋白基因 (VP2 VP4 VP3 )分别插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游 ,制备DNA疫苗 ,免疫 14日龄SPF鸡 ,14d后二免 ,二免后 3d攻击标准强毒株。结果表明共注射鸡IL 2质粒能明显增强DNA疫苗对强毒攻击 ,保护率达 80 % ;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价 (P <0 0 5 ) ;能显著促进鸡胸腺、脾脏和外周血液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应 (P <0 0 5 )。这些结果提示鸡IL 2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性 ,是一种优良的禽类DNA疫苗佐剂。

鸭的类似鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

通过 RT- PCR和 DNA测序技术 ,克隆和测定了绍兴麻鸭的一种类似鸡白细胞介素 2 ( IL- 2 )基因的核苷酸序列 ,并构建了该基因编码蛋白的三维结构分子模型。结果显示 ,绍兴麻鸭的类似于鸡 IL - 2基因的核苷酸长度由 74 8个碱基组成 ,编码产物为由 14 0个氨基酸残基组成的多肽 ,编码产物中含有 2 1个氨基酸残基组成的信号肽。绍兴麻鸭的类似于鸡 IL- 2基因的核苷酸及编码产物 ,与鸡和火鸡 IL- 2的一致性分别为 71.4 %～ 72 .1%和 5 5 .0 %～ 5 7.9% ,与哺乳类等动物 IL- 2的一致性分别为 2 2 .1%～ 2 8.8%和 14 .3%～ 17.1%。对绍兴麻鸭的类似于鸡 IL- 2基因蛋白编码产物的系统进化树分析表明 ,其编码产物与鸡和火鸡 IL- 2具有较远的亲缘关系。绍兴麻鸭的类似于鸡 IL- 2基因编码产物的三维结构 ,预测由 4个α-螺旋结构和 2个β折叠组成。这些研究结果预示 ,鸭的类似于鸡 IL - 2基因编码产物 ,在生物学功能上与哺乳动物和其他禽类具有很大的差异。

鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究

将含萧山鸡白细胞介素2基因的真核表达质粒pCI-IL-2的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111(ZJ111/pCI-IL-2)口服接种小鼠和雏鸡,并与传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗联合免疫雏鸡观察其免疫效力.结果表明:利用减毒沙门氏菌作为载体的鸡白细胞介素2口服免疫增强剂具有相对的安全性.重组ZJ111/pCI-IL-2菌能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒株攻击保护率;增强IBDV DNA疫苗诱导的抗体的效价(P<0.05);增强IBDV DNA疫苗所诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应(P<0.05).上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的白细胞介素2免疫增强剂具有良好的安全性和免疫增强作用,为研制低成本、实用化的禽类口服免疫增强剂奠定了基础.

重组鸡白细胞介素2的诱导表达与生物学活性测定

将去除信号肽的鸡IL-2基因编码框克隆到原核表达载体pBAD/HisB,实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE分析显示,表达蛋白的分子量约为18kD。用rchIL-2为抗原制备了单克隆抗体和多克隆抗体,建立了检测rchIL-2含量的抗原捕获ELISA,探讨了天然chIL-2蛋白的体外表达动力学。非变性条件下纯化的rchIL-2(0.4ng)对ConA活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性,而对鸭及鹅的T淋巴细胞无增殖活性。抗chIL-2多克隆抗体可完全中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白的生物学活性,而单克隆抗体无中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白生物学活性的功能。这些研究结果证实,大肠杆菌表达的rchIL-2及其多克隆抗体拥有生物学功能,而获得的单克隆抗体不具有chIL-2的中和特性。

鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究

将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白。重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达。HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性。

鸡白细胞介素2(IL-2)对鸡免疫功能的影响

为研究鸡IL-2对雏鸡免疫功能的影响,进行了3个方面的试验。①对体液免疫及细胞免疫的影响。结果表明,鸡IL-2能明显提高鸡新城疫疫苗免疫后HI水平、T淋巴细胞增殖反应及ANAE+细胞百分数;②对雏鸡腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。结果表明使用IL-2与否对巨噬细胞的吞噬功能没有明显的影响;③人工感染法氏囊病的防治试验。在攻毒前后注射IL-2,均可明显降低发病率和死亡率。本研究结果表明,鸡IL-2可明显提高特异性免疫应答能力,与疫苗共同注射可作为佐剂提高疫苗的免疫原性,对法氏囊等病毒性疾病具有一定的防治作用。

用DNA免疫研制鸡白细胞介素2单克隆抗体

构建鸡白细胞介素2(鸡IL-2)的真核重组质粒pcDNA-IL-2和原核重组质粒pET-IL-2,以重组质粒pcDNA-IL-2免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组质粒pET-IL-2在大肠杆菌BL21(DE_3)中诱导表达的蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后共获得3株针对鸡IL-2的特异性单克隆抗体,并对这3株单克隆抗体的特性进行了鉴定。

鸡白细胞介素2对La Sota弱毒苗免疫效果促进作用的初步研究

为研究鸡白细胞介素2对新城疫La Sota弱毒苗免疫效果的促进作用,纯化真核重组质粒pcDNAChIL-2,细胞转染验证后,将重组质粒分为0,5,10,20和30μg5个剂量组,分别与LaSota弱毒苗同时免疫7日龄雏鸡,免疫后7d,每隔1周分离鸡血清,测量血清中NDV的HI效价。结果表明,混合注射有pcDNAChIL-2重组质粒雏鸡的NDV抗体产生的水平显著升高,其中以20和30μg剂量组最为明显,提示ChIL-2可有效促进La Sota弱毒苗的免疫效果。

中国地方品种鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析(英文)

鸡白细胞介素 2 (chIL 2 )是近年来新发现的一类细胞因子 .根据Sundick等发表的鸡IL 2基因序列设计一对特异性引物 ,从ConA体外激活的脾淋巴细胞中提取mRNA ,通过RT PCR方法分别扩增和克隆了我国仙居鸡、丝羽乌骨鸡两个地方品种和艾维茵商品肉鸡IL 2cDNA .仙居鸡、丝羽乌骨鸡和艾维茵商品肉鸡IL 2基因的编码区均由 42 9nt组成 ,编码一个由 143个氨基酸组成的前体蛋白 .基因 5′端含有 17个核苷酸 ,3′端含有 2 85个核苷酸组成的非编码区 ,3′ UTR中含有 5个重复的“ATTTA”序列 .编码蛋白氨基酸与来自GenBank的Kestrel、Obese和SC品系的来杭鸡比较 ,氨基酸的突变主要发生在 2 8～ 3 2位 .而这一区域仙居鸡和丝羽乌骨鸡的编码氨基酸序列与Kestrel来杭鸡相同 ,艾维茵商品肉鸡与Obese和SC来杭鸡相同 .基因系统进化树分析表明 ,仙居鸡、丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡具有很近的亲缘关系 ,艾维茵商品肉鸡与Obese和SC来杭鸡具有很近的亲缘关系 .中国的药用鸡品种———丝羽乌骨鸡在非常保守的 13

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测

从ConA刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素 2 (ChIL 2 )基因编码区。将该编码区cDNA序列和调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子 (PE L)的基因片段定向克隆到鸡痘病毒转移载体p1175中 ,获得重组转移载体p1175IL2 ,然后转染已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株 (wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,质粒p1175IL2与wt FPV基因组DNA发生同源重组 ,产生了表达ChIL 2的重组鸡痘病毒rFPV IL2。通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑 ,获得并纯化重组鸡痘病毒rFPV IL2。应用XTT PMS方法检测的rFPV IL2 (M .O .I 2 0 )感染CEF 72小时后细胞上清中表达的重组ChIL 2生物活性 ,效价为 3 6× 10 5u mL ,表明rFPV IL2能有效地表达ChIL 2。下一步将利用rFPV IL2在体内表达ChIL 2 ,研究ChIL 2的免疫增强作用及其作用机理。

广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡白细胞介素2基因序列设计一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡的外周血淋巴细胞RNA中扩增,均得到大小为470 bp的特异性片断。将10个品种鸡的RT-PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒,经PCR和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定鸡白细胞介素2基因序列。序列分析结果表明:广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因都编码143个氨基酸的成熟蛋白,分子量约为16.3 ku,与哺乳动物和其他品种鸡核苷酸序列的同源性分别为24.8%-30.3%、98.8%-99.8%,氨基酸的同源性为14.6%-16.7%、96.5%-98.6%。

鸡白细胞介素2和白细胞介素18基因的原核及真核表达

【目的】克隆并原核和真核表达无特定病原(SPF)鸡白细胞介素2(ChIL-2)和白细胞介素18(ChIL-18)基因,为后续开展ChIL-2和ChIL-18蛋白功能、生物学活性及联合应用的免疫佐剂研究打下基础。【方法】运用RT-PCR扩增ChIL-2和ChIL-18基因,并进行测序和序列比对分析,分别构建其重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18及重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18,并将重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18分别转化大肠杆菌BL21,将重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18分别转染非洲绿猴肾(Vero)细胞。【结果】重组原核表达质粒pET32a-ChIL-2和pET28a-ChIL-18经IPTG诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明融合蛋白ChIL-2和ChIL-18在大肠杆菌中获得高效表达,表达的蛋白分子量分别为27和23 kD;重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-2和pVAX1-ChIL-18转染Vero细胞24 h后进行倒置荧光显微镜检测,结果显示融合蛋白ChIL-2和ChIL-18在Vero细胞中均有较高表达。【结论】克隆获得的ChIL-2和ChIL-18基因可在原核和真核细胞中高效表达。

新型免疫佐剂鸡白细胞介素2通过鉴定

近日．浙江大学动物预防医学研究所于涟教授主持的浙江省重大科技攻关项目“新型免疫佐剂鸡白细胞介素2的克隆、表达及应用研究”．通过了浙江省科技厅主持的成果鉴定和项目验收．

鸡白细胞介素-2抗家禽病毒病作用及机制研究进展

家禽病毒病严重危害我国养殖业的发展和公共卫生安全。鸡白细胞介素-2(Chicken interleukin-2,ChIL-2)是一类具有免疫活性的细胞因子,广泛参与非特异性免疫和特异性免疫应答,发挥重要的抗病毒作用,在动物疾病防治、新型免疫佐剂研发、提高动物抗病能力等方面具有广阔的应用前景。文章对ChIL-2的结构、ChIL-2介导的免疫信号通路及其在家禽病毒病的应用进行综述,旨在为研发新型家禽抗病毒药物和疫苗佐剂提供理论参考。

鸡α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2亚型病毒(AIV H9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。【结果】成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kD,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和IBDV活性明显高于单一rChIFN-α的抗病毒活性;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。IFN-α活性单位为200IU的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡和胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。合适剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性。【结论】rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性,这为进一步研究以rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。

鸡白细胞介素2基因的克隆、原核表达及功能研究

以RT-PCR法从鸡脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素2编码基因,通过双酶切、连接步骤克隆进原核表达载体pQE30及pGEX-4T-3,构建了鸡白细胞介素2基因的重组原核表达质粒pQE30-chIL-2及pGEX-chIL-2.重组质粒转化大肠杆菌JM109后经诱导表达,分别得到两种表达产物.以SDS-PAGE和Westernblot检测确认表达产物为带6组氨酸标签及GST蛋白的融合鸡白细胞介素2,分子量分别为16 kDa及39.5 kDa.表达蛋白与抗鸡白细胞介素2单抗均有良好的免疫结合性,进一步证实为鸡白细胞介素2.表达产物经过纯化复性后,具有明显促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用.

鸡白细胞介素-2受体基因γ链的转录分析与表达

以脾单个核细胞总RNA为模板，对鸡白细胞介素-2受体基因γ链（chIL-2Rγ）进行了RT—PCR，获得了-1047bp的开放阅读框，编码由348个氨基酸残基组成的分子质量为37．8ku的蛋白多肽。预测的鸡IL-2Rγ多肽链中包含4个保守半胱氨酸残基、1个WSXWS基序和7个N连接的糖基化位点。鸡IL-2Rγ与其他动物IL-2Rγ在氨基酸水平上的同源性仅为21．49／6～38．2％。RT—PCR检测发现，鸡IL-2RγmRNA分布于大脑、小脑、脊髓、腔上囊、脾、胸腺、骨髓、盲肠扁桃体、腺胃、肌胃、空肠、卵黄囊憩室、回肠、盲肠、直肠、心脏、肾、肺、肝、骨骼肌和皮肤，而在十二指肠和睾丸中没有检测到其转录。构建了鸡IL-2Rγ胞外区的原核重组表达载体，进行了表达和鉴定。

重组鸡白细胞介素-2对禽流感灭活疫苗免疫增强作用的研究

为研究重组鸡白细胞介素-2(IL-2)对H5N1亚型禽流感灭活苗的免疫效果,将重组IL-2蛋白和禽流感灭活疫苗联合免疫14日龄SPF鸡,免疫后每周测定一次血清抗体效价﹑脾脏T淋巴细胞亚群,最后计算攻毒保护率。试验结果表明:重组IL-2蛋白具有增强禽流感疫苗免疫效果的作用,提高了血清中的抗体水平﹑增加了脾脏T淋巴细胞CD4+﹑CD8+亚群数量。

鸡白细胞介素-2基因在Pichia methanolica酵母中的表达

鸡白细胞介素-2(chIL-2)是近年来新发现的一种禽类细胞因子.为建立用甲醇型酵母Pichiamethanolica(P.methanolica)表达鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)的新途径,将chIL-2基因插入到P.methanolica分泌型表达载体pMETαA构建了重组PMAD11表达菌株(pMETαA/rchIL-2).经SDS-PAGE、Western印迹测定,证实chIL-2基因在P.methanolica中表达成功,rchIL-2的分子量约为16kDa,其表达量占分泌总蛋白的35%.

重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白体外活性评价方法研究

为建立稳定、便捷的重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白,重组融合蛋白)体外活性评价方法,本研究分别采用ChIFN-α和ChIL-2ELISA方法检测重组融合蛋白与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性;采用细胞病变抑制法检测重组融合蛋白在DF1细胞上抑制水疱性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)增殖活性;采用MTS法分别测定重组融合蛋白促鸡外周血T淋巴细胞(PBLC)和脾淋巴细胞增殖活性。结果表明,重组融合蛋白可以与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应;重组融合蛋白在DF1细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV活性高于抗IBDV活性,且均明显高于rChIFN-α蛋白对照;不同浓度的重组融合蛋白均具有明显的促鸡PBLC和脾淋巴细胞增殖活性,且其促增殖活性明显高于rChIFN-α蛋白对照。本研究成功建立了重组融合蛋白体外活性检测评价方法,为进一步探究重组融合蛋白在鸡体内协同作用奠定基础。