鸡肺相关凝集素及其天然免疫机制

目前,鸡呼吸系统疾病已成为制约养禽业生产的主要问题,尤以肺部病变在病原菌参与下对鸡只健康造成不可逆转的危害为主。使用疫苗能够建立起机体的特异性免疫反应,但是抗体的产生需要一定的时间,在机体的特异性免疫反应建立之前,一旦有病原体侵入,机体将陷入困境。因此,从机体的非特异性免疫反应出发,寻找与家禽呼吸系统天然免疫防御功能有关的基因,并进而研究其功能,是降低呼吸系统疾病危害的重要途径。

鸡肺表面活性蛋白A的表达及其多克隆抗体的制备

目的表达鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)重组蛋白,并制备鼠抗cSP-A多克隆抗体。方法人工合成cSP-A的凝集素糖识别区(CRD)基因(cSP-A-CRD),亚克隆到pGEX-6P-1载体中进行原核表达,对表达产物进行鉴定。切胶纯化法纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备抗cSP-A多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法、免疫荧光组织化学染色和ELISA鉴定该抗体的特异性和适用范围。结果获得鼠抗cSP-A血清,效价达到105;Western blot法结果表明多抗血清具有良好的特异性和反应性,并可用免疫荧光组织化学技术检测鸡肺上皮细胞表达的cSP-A和用间接ELISA检测鸡肺灌洗液中存在的水溶性cSP-A蛋白。结论成功表达了cSP-A重组蛋白并制备了小鼠抗cSP-A多克隆抗体。

利用SMART技术构建鸡肺酵母双杂交cDNA文库

以1月龄SPF鸡肺为材料,用Trizol方法提取总RNA,并用mRNA纯化试剂盒纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。合成的ds cDNA通过CHROMA SPINTM TE-400 Column进行纯化,纯化后的ds cDNA与线性pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞AH109中,以同源重组的方式,在酵母细胞内构建成鸡肺的cDNA文库。获得的文库容量为3.9×106cfu,随机选取20个克隆进行PCR检测,插入片段大小集中在0.3～3.0kb之间,平均插入片段约为1.4kb左右,文库重组率为100%。结果表明该文库达到了高质量文库所应具备的条件,为酵母双杂交技术筛选与IBV-N相互作用的宿主细胞蛋白奠定基础。

超声波辅助酸提鸡肺胶原蛋白的持油性和乳化性

以鸡肺为原料,乙酸为提取剂,采用超声波辅助酸提法提取胶原蛋白,通过Box-Behnken试验设计分析法优化提取工艺。在单因素试验的基础上,以超声波功率、料液比和提取时间为因素,胶原蛋白得率为响应值,设计响应面试验,并比较常规酸提和超声波辅助酸提胶原蛋白的疏水性能、持油性能和乳化性能。结果显示,鸡肺胶原蛋白的超声波辅助酸提最佳条件为超声波功率365 W、料液比1∶90(质量体积比)、提取时间320 min,胶原蛋白得率占除杂后冻干鸡肺(干质量)的39.55%,其得率比常规酸提的提高了3.71倍;超声波辅助酸提的胶原蛋白疏水性、持油性和乳化活性分别比常规酸提的提高了64.0%、68.6%和32.4%。

两种方法提取的鸡肺胶原蛋白性质及保湿性研究

本文以鸡肺为原材料,利用酸提和超声辅助酸提法提取胶原蛋白,并对其性质及保湿性进行研究。结果表明,所提取的鸡肺胶原蛋白经氨基酸分析显示组成基本相似,甘氨酸含量最高,分别占24.12%和23.93%,亚氨基酸含量仅次之,分别占19.74%和22.28%。酸提和超声辅助酸提胶原蛋白在229.0和224.9 nm处有胶原蛋白的特征紫外吸收峰。SDS-PAGE显示两种鸡肺胶原蛋白中均含有α1链、α2链、少量的β链和γ链,傅里叶变换红外光谱及X-射线衍射图谱共同表明两种方法提取的鸡肺胶原蛋白分子排列紧密,均保持了原有的三螺旋结构,说明在超声辅助酸提过程中胶原蛋白的结构保持完好,三螺旋结构未被破坏。酸提的胶原蛋白等电点为7,粒径分布在340 nm左右;超声辅助酸提的胶原蛋白等电点为6,粒径分布在295 nm左右,结合胶原蛋白的溶解性说明了超声辅助酸提可破坏胶原蛋白的氢键,改变蛋白质的颗粒大小和聚集形态。扫描电镜结果表明超声辅助酸提的胶原蛋白结构呈连续纤维状并多孔,且颗粒直径明显减小。在放置24 h时,超声辅助酸提胶原蛋白的吸水性和保水性分别为常规酸提胶原蛋白的1.25倍和1.17倍。综上所述,超声辅助酸提未破坏胶原蛋白特有的三螺旋结构,通过改变氢键和蛋白的颗粒大小使得胶原蛋白具有更好的溶解性和吸湿保湿性。

高效酶提取鸡肺明胶及其结构与性质的研究

以鸡肺为原料,通过超声辅助酶法提取明胶,采用紫外光谱法、差示扫描量热法、圆二色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、激光粒度分布法、扫描电镜等分析超声辅助酶提鸡肺明胶的结构,并研究其乳化性质,探究该法在鸡肺明胶中的应用效果。研究结果表明,与常规热水提取法相比:超声辅助酶提法的明胶得率为30.08%(鸡肺除杂后干重状态原料),是前者提取的3.43倍,提取效率也提高了2.15倍,热变性温度为90.22℃,略低于前者;两种明胶均存在胶原的特征负吸收峰,出现在229 nm处,其中超声辅助酶提明胶的无规则卷曲程度低于常规热水提取明胶。平均粒径为396 nm,颗粒减小了13.7%,多数分布在相对分子质量45000~95000之间,已基本降解为小分子亚基,表面微观结构有明显的破碎;进一步分析发现,两种明胶样品的乳化性无明显差异。因此,超声辅助酶提法可显著提高明胶提取率,有效缩短了生产周期,鸡肺明胶还可作为乳化剂用于食品工业中,该方法制备的鸡肺明胶在食品领域具有潜在的应用前景,可进一步提高肉鸡副产物的附加值。

清热活血法对鸡肺热喘咳的疗效试验

为探讨用清热活血中草药对鸡肺热喘咳证的治疗效果,本试验选用150羽50-70日龄的符合肺热喘咳证的患病鸡,进行对比治疗试验。结果试验组治愈率和总有效率分别为40%和62%,治愈后不复发;药物对照组和不给药对照组的治愈率和有效率分别为22%、44%和8%、26%。其试验组的治愈率和总有效率极显著高于不给药对照组(P<0.01),死亡率为4%,亦比不给药对照组8%的死亡率低4个百分点。同时在试验期间平均增重试验组为148克,亦比不给药对照组的134克高出约10%。

连花柴芩可溶性粉治疗鸡风热犯肺证扩大临床试验研究

为了进一步验证连花柴芩可溶性粉对鸡风热犯肺证的临床疗效,在实验性临床研究基础上,进行扩大临床试验。将纳入研究的600只病鸡随机分为2组,每组300只,分别为试验组(2 g/L连花柴芩可溶性粉饮水给药)和不处理对照组,连续用药5 d,记录给药前后各组鸡只的精神状态、体温、呼吸道症状;采用量化分级评分法评价受试药物对鸡风热犯肺主证的临床疗效,同时记录分析各组鸡只的采食量和饮水量,综合评价受试药物对鸡风热犯肺证的临床疗效。结果显示,与不处理对照组相比,试验组鸡只平均体温显著降低(P<0.05),呼吸道症状显著改善(P<0.05),临床总有效率为90.34%;同时,试验组鸡只采食量与体质量显著提高(P<0.05),饮水量显著减少(P<0.05)。综上所述,连花柴芩可溶性粉对鸡风热犯肺所致的发热、咳嗽、食欲减退、口渴喜饮具有较好的缓解和治疗作用,其临床推荐用药方案为2 g/L,饮水给药,连用5 d。

鸡肺表面活性蛋白A的可溶性表达及活性检测

利用RT-PCR扩增鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)基因,将其连接pMD19-T Simple载体,经测序正确后,扩增成熟肽基因片段并酶切克隆入pCold-TF原核表达载体中,转化到感受态宿主菌BL21(DE3)中,加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于16℃诱导表达24h,超声波裂解,通过His·Tag纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE检测。结果扩增得到615bp的成熟肽基因片段;SP-A蛋白获得可溶性表达,融合蛋白的大小为80ku。Western-blot结果显示,该蛋白可被特异性多克隆抗体识别。抑菌试验结果显示,与纯化的天然cSP-A蛋白不同,cSP-A原核表达产物并不具备抑菌活性。

连花柴芩可溶性粉对鸡风热犯肺证的临床试验研究

【目的】研究连花柴芩可溶性粉对风热犯肺所导致的鸡发热、咳嗽、食欲减退、口渴喜饮等证候的临床疗效。【方法】采用鸡传染性支气管炎病毒人工攻毒建立风热犯肺证肉鸡病例模型,将出现典型风热犯肺证临床症状的150只鸡纳入到试验中,并随机分为5组,30只/组,分别为连花柴芩可溶性粉高、中、低剂量组(连花柴芩可溶性粉浓度分别为4、2、1 g/L),麻杏石甘颗粒药物对照组(1 g/L),模型对照组,另设30只为健康对照组。除健康对照组和模型对照组外,各试验组连续饮水给药5 d,记录给药前后鸡的精神状态、体温、呼吸道症状、采食及饮水的变化,并检测各组鸡的免疫器官指数、外周血免疫细胞亚群指标,综合考察连花柴芩可溶性粉的临床疗效。【结果】连花柴芩可溶性粉高、中剂量组对风热犯肺所致的鸡发热、咳嗽的总有效率分别为90.00%和86.66%,显著高于模型对照组(P<0.05),且对病鸡采食量下降、饮水量增多具有较好的缓解效果(P<0.05);连花柴芩可溶性粉能提高病鸡免疫器官指数,促进病鸡外周血中CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+) T淋巴细胞增殖,且连花柴芩可溶性粉高、中剂量显著高于模型对照组(P<0.05)。【结论】连花柴芩可溶性粉对风热犯肺所致的鸡发热、咳嗽、食欲减退、口渴喜饮具有较好的缓解和治疗效果,结合药物量效关系和经济成本等因素综合考虑,推荐连花柴芩可溶性粉临床应用剂量为2 g/L,饮水给药,连用5 d。

鸡SP-A在293T细胞中的表达及免疫学检测

为表达鸡肺表面活性蛋白A(chicken palmonary surfactant protein A,c SP-A)基因,本研究扩增去除终止子的c SP-A,通过Nhe I和Apa I双酶切,连接进入真核表达载体pc DNA3.1/myc-His(-)A中,构建获得重组载体pc SP-A;同时,将c SP-A和gfp基因按Nhe I-Bam H I和Bam H I-Apa I分别连接至pc DNA3.1/myc-His(-)A载体中,构建获得融合表达载体pc SP-A-GFP。通过脂质体法将这两类真核载体瞬时转染293T细胞,48 h后用4%多聚甲醛固定细胞,利用c SP-A特异性鼠多抗进行间接免疫荧光,于倒置荧光显微镜下观察c SP-A表达和亚细胞定位情况,然后收获细胞进行Western blot检测。结果发现,c SP-A在细胞质中表达,pc SP-A和pc SP-A-GFP融合蛋白的相对分子量分别约为30 k Da和55 k Da。上述研究结果为进一步研究c SP-A的功能奠定了基础。