“无泪配方”的评价体系建立与应用

发用类产品、易触及眼睛的护肤产品以及眼部彩妆上市之前,必须进行眼部刺激测试,以证明该产品对眼睛是安全的。“无泪配方”是这类产品常用的宣称,但是对于“无泪配方”的评估却缺乏相关的标准。本文旨在整合眼刺激相关的评价方法,建立一套更为全面的安全性评估体系,用于筛选和评估“无泪配方”。该评价体系包括第一层级的体外眼刺激测试、体外疼痛受体激活测试,第二层级的动物测试以及第三层级的临床试用测试和临床滴注测试。通过该体系,比较了两款开发中的儿童沐浴配方,筛选出眼刺激更低、更温和的产品。研究结果表明,此评价体系可以有效筛选出“无泪配方”,并为开发这类产品提供支持数据。

人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究

目的:在大肠杆菌中克隆和表达人源胸腺肽(thymosinβ4,TB4)基因并进行分离纯化及促血管生成生物活性鉴定。方法:人工设计TB4基因片段,其密码子为大肠杆菌所偏爱,将合成的寡核苷酸片段经分子克隆拼接成TB4基因片段,与pET28a(+)载体连接成重组表达质粒pET28a-TB4,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达带His6-Tag的融合蛋白His6-TB4,通过镍柱亲和层析纯化,采用SDS-PAGE分析鉴定,由CAM试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果:经DNA序列分析鉴定,重组质粒pET28a-TB4构建成功,IPTG诱导后的融合蛋白His6-TB4在大肠杆菌中得到高效表达,并经一步镍柱亲和层析即获得纯化。CAM试验证明其有促进毛细血管生成的活性。结论:获得高效表达的、高纯度的His6-TB4融合蛋白,为TB4的进一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了基础。

胡桃醌对血管形成的影响及其机制初探

目的:观察胡桃醌对内皮细胞系EAHY.926细胞活性和迁移性、大鼠主动脉微血管样结构和鸡胚尿囊膜血管生成的影响。方法:不同浓度胡桃醌作用于EAHY.926细胞株48 h后MTT法检测细胞存活率。大鼠主动脉无血清培养,加入100、50、25、12.5μmol/L浓度的胡桃醌,观察其对微血管结构的影响。选用7日龄鸡胚进行鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验。结果:200、100、50μmol/L浓度胡桃醌对EAHY.926细胞活性有明显的抑制作用(P<0.05),IC_(50)为122.848μmol/L;25、12.5μmol/L的胡桃醌促进EAHY.926细胞株的生长(P<0.05)。100、50、25μmol/L的胡桃醌均可抑制大鼠主动脉微血管形成(P<0.01),12.5μmol/L的胡桃醌可明显减少内皮细胞的爬行数量,延缓其爬行速度(P<0.01)。200、100、50、25μmol/L胡桃醌对鸡胚绒毛尿囊膜已存在的血管有不同程度的刺激作用,出现不同程度的充血、出血,最终凝血,且呈剂量依赖性;而12.5μmol/L的胡桃醌作用区域无新生血管形成。结论:胡桃醌具有抗血管生成作用。

小鼠endostatin基因的克隆、表达及表达产物的活性鉴定

目的 克隆并表达小鼠 endostatin基因 ,并初步检测其血管生长抑制功能 ,为胶质瘤的基因治疗探索新的途径 .方法 从小鼠肝组织用 RT- PCR法扩增 endostatin基因 ,重组入 p UC19质粒 ,经测序证实无误后 ,重组入表达载体p DH,经温度诱导表达 ,并用鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)实验检测表达产物活性 .结果 从小鼠肝组织中成功扩增到endostatin基因 ,测序与报道序列一致 .重组进 p DH后经温度诱导表达 ,在 SDS- PAGE电泳上得到一条新的蛋白表达带 ,分子质量为 2 0 ku.纯化后的蛋白能明显抑制 CAM的血管生长 .结论 成功构建了小鼠 endostatin c DNA的重组克隆p DH- Endo,并在大肠杆菌中获得高效表达 .在 CAM实验中表明纯化后的蛋白具有明显血管抑制作用 .

人canstatin cDNA分泌型真核表达载体的表达及生物学作用研究

目的将人canstatin cDNA分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞并获得稳定表达canstatin蛋白产物的细胞株。再进一步研究表达产物的生物学作用。方法将人canstatin cDNA的重组1质粒pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞,应用RT-PCR、western-blotting法检测表达产物,再用多种方法进一步研究canstatin的生物学作用。结果成功的将pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞并鉴定出上清液中有目的蛋白的表达。该细胞培养上清液能抑制鸡胚绒毛尿囊膜中微血管的生成,抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)的生长并诱导其凋亡。结论①成功的将pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞并获得能稳定表达can-statin蛋白产物的细胞株;②证实含canstatin蛋白产物的细胞培养上清液具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜微血管生成的活性并可在体外抑制HUVEC-12的生长和诱导其凋亡。

重组人纤溶酶原Kringle1-3的生物学活性鉴定

目的:检测重组人纤溶酶原Kringle1-3(K1-3)的生物学活性。方法:用含重组人纤溶酶原K1-3基因的表达载体pET21a-Angio(K1-3)转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,表达产物经溶解、复性和纯化后,进行SDS-PAGE,计算其相对分子质量;用BCA法测蛋白浓度,用细胞抑制实验(MTT法)和鸡胚绒毛膜尿囊膜(CAM)实验鉴定纯化产物对血管内皮细胞增殖和血管生成的抑制效果。结果:表达产物的相对分子质量为38000,与预期值一致;细胞抑制实验和CAM实验结果表明表达产物具有特异抑制血管内皮细胞增殖、血管生成的功能。结论:所纯化的重组人纤溶酶原K1-3具有抑制血管内皮细胞的生物学活性,为该蛋白在病理性血管疾病等方面的应用研究提供了材料。

CCR5亲和短肽抗肿瘤活性研究

目的探讨趋化因子受体CCR5亲和短肽(AFDWTFVPSLIL)对肿瘤生成作用的影响。方法通过MTT实验、细胞凋亡实验检测短肽对血管内皮细胞生长的影响,通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测短肽对血管生成的影响,通过体内抑瘤实验检测短肽对实体瘤生长的作用。结果短肽能通过诱导人脐静脉血管内皮细胞的凋亡来抑制内皮细胞的生长;并能抑制CAM膜的血管生成。短肽也能在体内抑制小鼠B16黑色素瘤的生长活性,其抑瘤率达68.6%。结论初步证明短肽具有抗肿瘤生成作用,且这种作用可能是通过抑制肿瘤的血管生成来实现。

大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化

目的优化新一代重组人内皮抑素(rhED)的复性方案并检测其抗血管生成活性。方法用6 mol/L盐酸胍溶解rhED包涵体后,用稀释法与透析法相结合的方法进行复性,优化最适复性条件。复性结束后用阳离子交换层析纯化。并用rhED特异性单抗和鸡胚绒毛尿囊膜实验检测复性后蛋白的活性。结果通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%。复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜实验中显示出抑制血管生长的活性。结论提高rhED复性率的复性条件可极大地促进新一代rhED的临床前及临床研究。

原核表达活性内源性血管生成抑制剂canstatin蛋白

目的构建canstatin原核表达载体,表达重组人canstatin蛋白,并验证其生物学活性。方法利用BamH Ⅰ和HindⅢ从重组质粒pUCm-T／canstatin上切下canstatin基因,插入表达质粒 pET-22b(+)相应位点,转化E.coli BL21。异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,SDS- PAGE电泳分析蛋白表达情况。超声破碎菌体,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白,PBS对其透析复性。鸡胚尿囊膜(CAM)实验验证目的蛋白抗血管生成活性。结果重组质粒pUCm-T／canstatin在 BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,电泳证实切下目的基因canstatin cDNA,将其插入质粒pET-22b(+)相应位点,转化E.coli BL21后,琼脂板上生长出多个白色菌落。挑选7个白色菌落做BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,所有菌落均切出分别对应原质粒与目的基因的2条特异性条带,证实均为阳性克隆。IPTG 诱导其中1个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白表达条带,诱导后1、2、3、4 h表达蛋白占菌体总蛋白百分比分别为18．2％、18．8％、23．0％和23．4％。Ni- NTA柱亲和层析后,在125、250mmol／L洗脱液中纯化出目的蛋白。CAM实验显示重组人canstatin 蛋白能抑制新生血管形成,且与剂量呈正相关。结论成功构建了canstatin原核表达载体,表达并纯化出有活性的重组人canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。

抗KDR单链抗体阻断VEGF/KDR通路的活性研究

为了阻断VEGF与KDR的结合,抑制VEGF结合KDR后介导的内皮细胞迁移和血管新生,实验室已经从全人源噬菌体展示抗体库中筛选得到几种抗KDR的单链抗体,从中挑选一种亲和力较高的抗体命名为AK506进行周质表达,纯化后经SDS-PAGE鉴定,可获得纯度为95%的电泳纯抗体,产量可以达到每升发酵液1 mg。经表面等离子共振技术测定,AK506与KDR胞外区相互作用的平衡解离常数为7.99×10-9nmol/L。细胞ELISA分析显示,AK506与内皮细胞表面膜受体KDR的结合呈剂量依赖性。采用细胞划痕损伤修复实验和鸡胚尿囊膜实验证明,AK506可以显著抑制内源性VEGF诱导的血管内皮细胞迁移和新血管生成,具有进一步研究开发用于抗肿瘤血管生成治疗的潜力。

整合素阻断多肽HM-3体外抑制新生血管的研究

研究整合素阻断多肽HM-3体外对血管生成的作用。应用鸡胚尿囊膜实验、大鼠动脉环实验及Matrigel实验考察整合素阻断多肽HM-3抗血管生成作用。结果:鸡胚尿囊膜实验和大鼠动脉环实验表明HM-3能够抑制体外血管生成,多肽HM-3 0.05μg对鸡胚尿囊膜新生血管生成的抑制作用最强,多肽HM-3 8μg/mL对大鼠动脉环微血管生成抑制作用最强。Matrigel实验表明HM-3 7～8μg/mL对内皮细胞生长因子添加剂(ECGS)诱导的HUVEC细胞体外分化成管状结构抑制作用最强。整合素阻断多肽HM-3具有显著的体外抗血管生成的作用。

重组人proEMAPⅡ/p43体外抑制新生血管生成活性方法的建立

目的建立proEMAPⅡ/p43蛋白体外检测抑制新生血管生成活性的方法。方法利用内皮细胞增殖实验、细胞周期实验、细胞迁移实验、管腔形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜实验等体外检测血管生成的模型,研究p43蛋白抑制血管生成的活性。结果 p43蛋白能明显抑制内皮细胞迁移和管腔形成,但对内皮细胞增殖和细胞周期没有明显的量效关系。结论最终选用细胞迁移实验和管腔形成实验作为主要活性检测方法,细胞迁移实验作为p43蛋白活性的定量检测方法,迁移抑制率作为活性高低的评价标准,管腔形成实验用于p43蛋白活性的定性研究。