Pcgf2促进鸡胚成纤维细胞重编程形成诱导多能干细胞

【目的】以提高诱导鸡多能干细胞的干性为目的,利用Pcgf2基因与传统诱导多能干细胞的重编程因子共同诱导鸡多能干细胞。【方法】以鸡早期胚胎为模板,对Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、C-myc、Klf4这6种传统的重编程因子及Pcgf2进行基因扩增,并与慢病毒载体重组为慢病毒质粒,在包装慢病毒并测定相对应的病毒滴度后,分组感染鸡胚成纤维细胞,在诱导的过程中对干细胞标记物进行检测。【结果】利用传统的重编程因子组合与加入Pcgf2共同诱导后的细胞都较早地表达出磷酸酶活性。加入Pcgf2诱导多能干细胞可以使细胞更早地出现类干细胞形态,且内源性基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表达得到更稳定的提高。【结论】Pcgf2在加入诱导体系后可以有效提高细胞的重编程接近干细胞状态。该研究可为选择重编程因子诱导鸡细胞完全重编程及其机制研究提供理论参考。

温度对鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1的影响

本文通过在不同温度条件下进行鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1细胞培养实验,同时模拟活细胞株常温运输环境寻找改善UMNSAH/DF-1细胞生长状态及胞体“空泡化”现象的方法。实验结果表明:相较于37℃,39℃的培养温度更有利于UMNSAH/DF-1细胞生长。室温运输时UMNSAH/DF-1细胞“空泡化”程度显著。但是正常传代后,其胞体“空泡化”现象又会显著减少。本文提示:若UMNSAH/DF-1细胞胞体“空泡”数量较多时,可通过优化该细胞最佳生长温度同时增加传代次数进行改善,一般多次传代后UMNSAH/DF-1细胞就会恢复至其正常状态。

鸡传染性法氏囊病毒接种鸡胚成纤维细胞工艺优化

鸡传染性法氏囊病是一种急性、高度接触性传染病,主要侵害幼龄鸡。传染性法氏囊病灭活疫苗通常采用强毒接种鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒的培养。本试验采用细胞培养转瓶培养CEF方法接种病毒对转瓶内细胞接种密度、种毒接种量及收获病毒时间进行了优化,筛选出传染性法氏囊病毒培养的最佳工艺参数(转瓶),为扩大生产稳定的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗奠定了基础。

一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究

为了进一步提高鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)的制备效率和活力,试验以短时多次消化法缩短胰酶消化时间,提高细胞活力。同时,通过优化血清、胰酶、培养基等保存条件,增加细胞4℃保存时间。经CCK-8细胞活性检测、活细胞计数、传代培养等方法比较验证,结果表明,所建立的制备方法简易、快速、细胞活力高;细胞在4℃、不添加血清和胰酶的DMEM培养基中保存96 h内仍保有良好的贴壁生长能力。该方法的建立为实验室内快速制备CEF细胞提供候选方案,可有效减少鸡胚的使用。

先导编辑在鸡胚成纤维细胞系中的效率研究

为探究先导编辑在鸡细胞系中的基因编辑效率,研究通过点突变和重组连接的方式构建先导编辑的表达质粒,使用在线软件设计并化学合成靶向OVM、MSTN和NHE1基因的先导编辑引导RNA(pegRNA)质粒,脂质体转染上述质粒至鸡胚成纤维细胞系(DF-1)中并进行药物筛选,PCR产物TA克隆测序检测并统计各位点的编辑效率。结果显示:测序和PCR鉴定结果表明先导编辑表达质粒构建成功;DF-1中OVM基因经先导编辑后成功产生错义突变,其中精确编辑效率为41.10%、错误插入与缺失(indel)效率为6.67%,均显著优于对照组的常规基因编辑(P<0.05);MSTN基因的先导编辑精确编辑效率为10.24%、indel效率为13.57%,NHE1基因的先导编辑精确编辑效率为24.88%、indel效率为7.18%。结果验证了先导编辑在鸡细胞系中的有效性和普适性,为其进一步应用于基因编辑鸡的制备奠定基础。

基于CRISPR-Cas9技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系

为研究甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet methylcytosine dioxygenase 2,TET2)及其介导的羟甲基化修饰在调控天然免疫反应中的作用,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系。针对鸡TET2 mRNA的2种剪接变体的共有CDS序列设计4组sgRNA,构建sgRNA表达质粒,连同Cas9-T2A-GFP质粒共转染DF-1细胞,筛选高切割效率的sgRNA;将转染该sgRNA的DF-1细胞,进行流式细胞分选,获取表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的细胞,再通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并用DNA测序进行鉴定。单克隆敲除细胞扩大培养后,Western blot和Dot blot检测TET2蛋白的表达水平和羟甲基化(5hmC)水平。DNA测序结果表明,TET2-gRNA-2靶位点附近分别发生2和28 bp的缺失突变,引起TET2蛋白移码突变,将该细胞株命名为DT-6。DT-6细胞传代15次以上,细胞形态稳定。Western blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞几乎不表达TET2蛋白。Dot blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞全基因组羟甲基化水平显著降低。利用CRISPR-Cas9技术成功构建了敲除TET2基因的鸡胚成纤维细胞系,为研究鸡TET2及其介导羟甲基化修饰参与调控天然免疫反应的途径和分子机制奠定基础。

10种中药成分对单层鸡胚成纤维细胞增殖的影响

将安全浓度范围内的黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、淫羊藿多糖、板蓝根多糖、黄芪黄酮、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、黄芪皂苷和人参皂苷等 10种中药成分分别加入已培养 2 4h、刚形成单层的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中 ,在加药后12 ,2 4 ,36 ,4 8和 6 0h用MTT法测定它们对CEF增殖的影响。结果表明 ,黄芪皂苷、黄芪多糖、板蓝根多糖和蜂胶黄酮主要表现为促进增殖 ;淫羊藿多糖主要具抑制效应 ;其他 5种中药成分在某些浓度和时间点能促进增殖 ,而在某些浓度和时间点则抑制增殖 ,并有一定的量效和时效关系。

8种硫酸化多糖对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响

用氯磺酸-吡啶法修饰当归多糖(CAPS)和枸杞多糖(LBPS),得到4种硫酸化当归多糖sCAPS0.6、sCAPS1.1、sCAPS1.9、sCAPS2.2和4种硫酸化枸杞多糖sLBPS0.7、sLBPS1.1、sLBPS1.5和sLBPS1.9。分别以CAPS和LBPS为对照,采用MTT法比较了这8种硫酸化多糖对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响。结果表明:硫酸化修饰能显著提高当归多糖和枸杞多糖的抗病毒活性,且与硫酸基取代度有一定的相关性。sCAPS2.2、sLBPS1.5、sCAPS1.9和sLBPS1.9的活性较好,可以作为进一步研究的材料。

鸡胚成纤维细胞原代培养及应用

原代培养是指在体外模拟体内生理环境,使从体内取出的组织细胞生存、生长和传代,并维持原有组织细胞的结构和功能特性。鸡胚成纤维细胞具有相对容易获得、增殖能力强、适应性强、良好的耐受性、性状比较稳定等特点,使得其被广泛地应用于分子和细胞生物学研究的许多方面。论文综述了近年来有关鸡胚成纤维细胞的培养技术,如鸡胚的取材、细胞的分离、纯化和培养,同时介绍了应用进展和未来研究方向。

10种中药成分对鸡胚成纤维细胞生长的影响

将鸡胚成纤维细胞 ( CEF)分别与当归多糖 ( CAPS)、黄芪多糖 ( APS)、板蓝根多糖 ( IRPS)、淫羊藿多糖 ( EPS)、蜂胶多糖 ( PPS)、淫羊藿黄酮 ( EF)、蜂胶黄酮 ( PF)、黄芪黄酮 ( AF)、黄芪皂甙 ( AS)和人参皂甙 ( GS)等 10种中药成分一起加入到 96孔细胞培养板中培养 ,分别在培养 2 4、36、4 8、6 0、72 h时用 MTT法测定中药成分对 CEF增殖的影响。结果表明 ,所有中药成分均能显著促进 CEF增殖 。

鸡胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

选取对新城疫病毒（NDV）易感的鸡胚成纤维细胞（CEF）,Trizol提取细胞总RNA,用SMART技术合成双链cDNA,然后利用同源重组的方法在酵母细胞内构建CEF的cDNA文库,以寻找与NDV基质（M）蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,探讨其相互作用对NDV装配和出芽的影响。结果表明：提取的细胞总RNA的D260 nm/D280 nm为1.96,甲醛变性琼脂糖凝胶显示RNA未发生降解,质量良好。获得的文库容量为3×106cfu,插入的双链cDNA片段大小为0.3~3 kb,平均长度为1.3 kb左右,文库重组率为100%。该文库的构建为发现和研究与NDV M蛋白相互作用的宿主细胞蛋白提供有效工具。

马立克氏病病毒pp38基因真核表达质粒的构建及其在鸡胚成纤维细胞中的表达

通过 PCR方法扩增马立克氏病病毒 (Marek′s disease virus,MDV) Md11株的 pp38基因 ,并将其克隆到真核表达载体 pc DNA3.1/ zeo(+)中。阳性克隆鉴定后 ,在脂质体作用下转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过间接免疫荧光试验 (IFA)检测到了 pp38在 CEF中的表达。

致病性鹅源新城疫病毒对鸡胚成纤维细胞的致病变特性

选择4株鹅源新城疫病毒(NDV)接种鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物,研究鹅源NDV对CEF的致病变特性,并与鸡源及鸽源NDV进行比较。结果显示,鹅源NDV接种次代CEF后24h开始有病变产生,表现为少数细胞变圆、皱缩,折光性增强,随后病变缓慢进展,感染细胞形成大量合胞体,到84-144 h时,CEF单层彻底破坏;鸡源和鸽源NDV接种CEF后也在24 h左右开始有病变产生,最初病变与鹅源毒株导致的病变相似,但病变进展迅速,细胞显著裂解并导致单层的严重破坏,60-84 h时细胞单层即彻底破坏。对病毒接种后不同时间段培养物上清血凝(HA)效价的测定结果表明,鹅源NDV接种后84-120h培养物上清HA效价达到高峰,为5-8 log2,鸡源和鸽源NDV接种后60-84 h HA效价即可达到高峰,但其最高效价只有4 log2。

不同制备方法对鸡胚成纤维细胞产量的影响

采用传统法、半胚法和全胚法制备鸡胚成纤维细胞 (CEF)单层 ,在同等条件下均以成纤维细胞为主 ,并伴有少量的上皮细胞 ,仅有全胚法含有极少量的肝细胞 ;培养时细胞贴壁和生长状况 3种方法无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;CEF的产量 ,半胚法明显高于其他

紫苏叶注射液在鸡胚成纤维细胞体系中安全浓度的测定

采用体外细胞培养法,将紫苏叶注射液与鸡胚成纤维细胞(Chick embryo fibroblast,CEF)共同培养,测定紫苏叶注射液在鸡胚成纤维细胞培养体系中的最大安全浓度,检测紫苏叶注射液的细胞毒性。结果表明,紫苏叶注射液对鸡胚成纤维细胞的最大安全浓度为488.281μg/mL。

鸡胚成纤维细胞和马立克氏淋巴瘤细胞端粒酶基因的表达水平

应用改进的TRAP-银染法检测了鸡胚成纤维细胞(CEF)和马立克氏淋巴瘤细胞系(MDCC-MSB1)的端粒酶活性,并应用荧光相对定量RT-PCR法,检测了这2种细胞中的端粒酶基因:端粒酶反转录酶(Telomerase reverse tran-scriptase,chTERT)和端粒酶RNA(Telomerase RNA,chTER)的相对表达量,以探讨端粒酶活性与基因表达的相关性。结果显示,MDCC-MSB1细胞的相对端粒酶活力是CEF细胞的100倍;实时荧光定量检测,MDCC-MSB1细胞中chTERT的mRNA表达水平高于chTER基因,其中chTERT基因的表达量为CEF的215倍,而chTER基因的表达量只有CEF的10倍。研究表明,chTER基因在CEF和MDCC-MSB1的表达差异不显著,而chTERT基因的mRNA表达水平在MDCC-MSB1细胞中却显著增加,说明chTERT是端粒酶活性的主要限速步骤之一,也可能是导致马立克氏病淋巴瘤的重要因素。

12种藏药对鸡胚成纤维细胞的安全浓度和生长的影响

用MTT法测定了藏菖蒲、红景天、决明子、灵芝盖、灵芝柄、龙胆、天冬、降香、乳香、仁青芒觉、二十五味珍珠丸、二十五味松石丸等12种藏药对体外培养的鸡胚成纤维细胞（CEF）的安全浓度和生长的影响。结果显示，各藏药的最大安全质量浓度红景天为31．25mg／L，天冬、降香、决明子和二十五味松石丸为62．5mg／L，乳香为125mg／L，二十五味珍珠丸为250mg／L，藏菖蒲和灵芝柄为1000mg／L，龙胆和仁青芒觉为2500mg／L，灵芝盖为5000mg／L，藏菖蒲为1．954-500mg／L，天冬为1．954-15．625mg／L，决明子为1．954-3．907mg／L，灵芝柄为1．954-7．813mg／L，仁青芒觉为19．54-1250mg／L，龙胆为312．5-625mg／L，可显著促进细胞生长。

新城疫病毒Ⅰ系毒株通过Caspase途径诱导鸡胚成纤维细胞凋亡

应用不同Caspases抑制剂研究了新城疫病毒(NDV)Ⅰ系毒株诱导鸡胚成纤维细胞(CEF)凋亡的途径。结果,用20μmol/L的Z-VAD.fmk、Z-IETD.fmk和Z-LEHD.fmk分别处理CEF后,均能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡;而用20μmol/L的Z-DEVD.fmk和Z-AEVD.fmk分别处理CEF,则不能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡。由此表明,NDVⅠ系毒株能通过Caspase依赖性途径诱导CEF凋亡,其中Caspase-8和Caspase-9在凋亡中发挥重要作用,而Caspase-3和Caspase-10在凋亡中不发挥作用。

鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库的构建

鸡胚成纤维细胞(CEF)是研究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要细胞材料,而构建CEF的cDNA表达文库是筛选IBDV在CEF中的细胞受体,研究细胞嗜性的基础平台。采用Gateway技术构建CEF的表达文库,避免使用限制性内切酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。该技术将CEF的mRNA分离纯化后,以5′端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接Adapter,层析柱纯化,通过BP重组反应构建cDNA入门文库,其平均滴度为1.1×106cfu/mL,文库总容量为1.2×107cfu,平均插入片段为2243bp,重组率为100%。通过LR重组反应将入门文库转换为表达文库,经测定平均滴度为5×105cfu/mL,文库总容量为5.5×106cfu,平均插入片段为2411bp,重组率为100%。结果表明,所构建的文库具有较高的重组率和较大的库容量,可作为较高质量的文库来研究IBDV的相关基因,为研究病毒受体和病毒入侵途径,进一步了解IBDV的致病机理奠定了基础。

鸡胚成纤维细胞感染IBDV后SOD活性的变化

鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦｓ）用传染性囊病病毒（ＩＢＤＶ）感染后，采用邻苯三酚自氧化法测定细胞超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的活性。ＣＥＦｓ感染ＩＢＤＶ后８ｈ，细胞ＳＯＤ活性有所上升。之后，随着时间的延长，细胞ＳＯＤ活性逐渐下降。试验结果表明，ＳＯＤ活性降低是ＣＥＦｓ感染ＩＢＤＶ之后发生的重要生化变化，在ＩＢＤＶ诱导细胞凋亡的过程中可能起关键作用。