禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水-肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞(LMH)对病原进行分离,采用PCR、透射电镜(TEM)观察和间接免疫荧光试验(IFA)对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体(SPF)鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸(cGAS)、干扰素刺激因子(STING)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、干扰素调节因子7(IRF7)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列(43708 bp);遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30453-30674 bp,第2个发生在36884-36988 bp,第3个发生在43401-43715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照(DMEM/F12处理)相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ-β差异达极显著水平(P<0.01),IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平(P<0.05),STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

抗生素疗法和中药治疗对鸡腺病毒感染的治疗效果比较

鸡腺病毒病是一种常见的家禽疾病,目前主要采用抗生素和中药治疗来控制病情。本研究旨在比较抗生素疗法和中药治疗对鸡腺病毒感染的治疗效果,通过对比临床数据和实验室检测结果,探讨两种治疗方法的优缺点和适用场景。结果显示,中药治疗在疗效上相对较优,但需要较长的治疗时间和个体化的配方,而抗生素疗法则有一定的抗菌作用和快速的治疗效果,但易产生耐药性和副作用。因此,针对不同的病情和治疗需求,选择合适的治疗方法是至关重要的。

鸡腺病毒血清8a型毒株的分离鉴定及致病特点

【目的】鸡腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)在鸡群中流行广泛且血清型众多,不同血清型毒株对鸡的致病能力尚不完全清楚。通过对FAdV-8a型分离株的致病特点进行研究,为了解血清8a型毒株的致病能力、进而对鸡群中不同血清型FAdV的防控提供科学依据。【方法】2017年,从发病鸡群采集肝脏组织,组织匀浆后无菌处理,接种鸡胚分离病毒,经PCR鉴定,初步确定分离毒株为鸡腺病毒。为确定分离株的分类情况,对病毒的全基因组进行测序及序列分析,经基因组序列比对及hexon基因遗传演化分析,从分子水平确定病毒的种/血清型。为了解分离株的致病特点和致病能力,30只10日龄SPF鸡随机分成2组,经滴鼻和点眼途径人工感染。从临床发病(发病率和死亡率)、病毒血症、排毒、循环抗体消长规律及其与中和抗体相关性、感染后5 d鸡剖检症状及病理组织学检测、病毒的组织分布及组织嗜性等方面评价分离株JL/170408对10日龄SPF鸡的致病性。【结果】对分离株的全基因组序列进行测定和分析,表明基因组序列与FAdV-8a型参考毒株TR59株同源性最高,基因组结构和编码基因特点与该毒株高度一致。基于全基因组序列进行遗传演化分析,分离株处于FAdV-E种的进化分支内,与TR59株亲缘关系较近。同时对分型基因hexon基因进行遗传演化分析,分离株划分为8a血清型。综合分离株基因组特征及遗传演化分析,确定分离株JL/170408为FAdV-E种、血清8a型毒株。分离株感染10日龄SPF鸡,感染后3—13 d是临床发病高峰期,但不引起鸡只死亡。感染后3 d开始出现病毒血症并经呼吸道和消化道排毒,病毒血症持续时间长达51 d之久,此时感染鸡的抗体未全部转为阳性且循环抗体滴度较低(平均S/P<1),低水平的循环抗体不能有效清除病毒。感染后54 d,感染鸡抗体滴度出现高峰(平均S/P>2),有效清除感染鸡体内病毒,表现为病毒血症消失和排毒明显下降。对感染后5 d的鸡剖检和病理组织学检测,未见明显病理组织学变化,但是荧光定量PCR可检测到15个组织中有不同程度的病毒载量,病毒的组织嗜性广泛且对肌胃有一定的偏嗜性。对循环抗体监测发现,感染鸡抗体阳转出现的较晚,感染后15 d部分鸡只抗体阳性,感染后24—51 d,循环抗体处于相对平稳状态,但此时感染鸡抗体未全部阳性。感染后54d出现了循环抗体滴度的高峰,提示鸡只可能发生再次感染,到感染后63 d,循环抗体滴度开始下降,有2只鸡的抗体转为阴性。对感染后63 d的血清进行中和抗体测定,并与循环抗体相比较,两者之间无明显相关性。【结论】FAdV-8a型分离株JL/170408可单独致10日龄SPF鸡发病,但不引起死亡,为低致病力毒株。JL/170408的组织嗜性广泛,对肌胃具有偏嗜性,感染后鸡只排毒时间长,排毒具有反复性。

亮斑扁角水虻幼虫生物转化对鸡粪中FAdV-4的消减作用研究

将亮斑扁角水虻幼虫(black soldier fly larvae,BSFL)接入含禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的鸡粪中(0~18 d),采用TaqMan qPCR和16S rDNA高通量测序分析了BSFL转化过程中FAdV-4含量的动态变化和微生物区系演化。结果表明,BSFL转化能够显著消减鸡粪中的FAdV-4群体载量,转化18 d时FAdV-4减少率达到了99.63%,明显高于对照组(64.74%),并且增加BSFL接种量和日龄能增强对FAdV-4的消减作用;BSFL转化使得物料中的细菌多样性显著降低;厚壁菌门、假单胞菌属受到抑制,而拟杆菌门、异常球菌-栖热菌门丰度则明显提高;居绿藻菌属、特吕珀菌属在BSFL转化体系中与FAdV-4消减密切相关。

禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的转录组学功能分析

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是引起禽肝炎-心包积液综合征的重要病原,严重危害我国养禽业的发展。研究表明,FAdV-4六邻体(Hexon)蛋白是决定病毒毒力和致病性的重要因素之一。为了进一步探究Hexon蛋白在FAdV-4感染中的重要作用,本试验以鸡肝癌细胞(LMH)为研究模型,利用转录组测序技术对外源表达Hexon所诱导的差异表达基因进行筛选。结果显示,与对照组相比,外源表达Hexon试验组共筛选到445个差异基因表达上调,36个差异基因表达下调。其中,BAG3、JUN、IL8L1、CCL4和THBS1等基因之前已被报道与FAdV-4感染相关,但HSPB9、HSP90AA1、HSPA8、HSPA2、DCN、ELOVL3和SBK2等基因在FAdV-4感染中的作用还未被揭示。GO富集分析结果显示,下调的差异基因主要与早期内体和蛋白酶体附属复合体相关,而上调的差异基因主要与质膜、细胞外表面区域和超分子纤维相关。KEGG通路富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在MAPK、Wnt和VEGF等信号通路。此外,通过蛋白质相互作用网络分析发现,HSP90AA1、HSPA8、JUN和DCN等多个关键蛋白位于整个网络中心且已被报道与多种病毒复制密切相关。综上所述,本研究通过转录组测序筛选出一系列由外源表达Hexon诱导的差异表达基因,为控制FAdV-4感染提供了新的靶点和理论依据。

鸡的Ⅰ群禽腺病毒病的防控技术

鸡腺病毒在禽类中广泛存在,可从正常鸡、病鸡以及火鸡、野鸡、鸽、鹑和鹅等禽类中分离到。禽腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个群(或称3个型);Ⅰ群感染可以引起鸡包涵体肝炎和心包积液综合征,Ⅰ群中有A、B、C、D、E5个种,12个血清型,但不同血清型的致病性差异较大。

一起来航鸡感染禽4型腺病毒的诊断

2021年9月,福建省某鸡场存栏的2000羽来航鸡出现大批量死亡,患鸡于35日龄发病,发病率约50%,病死率达70%,结合流行病学特点、病死鸡的剖检病变和病原学检测确定该鸡群感染禽4型腺病毒(FADV-4)。

蛋鸡Ⅰ亚群禽腺病毒与大肠杆菌混合感染的诊断

腺病毒科目前被分为哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属,其中禽腺病毒属包含14个与禽类有关的腺病毒种,它们具有共同的抗原性。根据群特异性抗原的差异,禽腺病毒属被分为3个亚群,Ⅰ亚群禽腺病毒主要引起鸡包涵体肝炎、心包积水综合征和肌胃糜烂症,Ⅱ亚群禽腺病毒主要引起火鸡出血性肠炎,Ⅲ亚群禽腺病毒主要引起鸡减蛋综合征。根据六邻体基因和血清交叉中和试验,已分离的I亚群禽腺病毒可进一步分为禽腺病毒A、B、C、D、E 5个种,包含12个血清型(血清1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型)。其中,血清4型Ⅰ亚群禽腺病毒感染是我国家禽中流行的优势血清型。

腺病毒载体介导的GFP在鸡胚成纤维细胞中的表达及RNA干涉

鸡胚成纤维细胞(CEF)是多种动物及人类病毒的易感细胞;也是研究鸡的基因组功能的理想材料.本试验的目的是研究非复制型腺病毒载体对CEF的转染效率及安全性;并建立在CEF细胞中进行RNAi的技术平台.采用GFP重组非复制型腺病毒载体(Ade-GFP)转染CEF细胞;结果证明0.1-2000 MOI Adv-GFP均可转染CEF细胞并表达GFP;转染后16h开始出现GFP阳性细胞;胞核与胞浆可见明亮的荧光;荧光细胞数量及荧光强度在24～36h达到高峰;以后逐渐衰减;约180h全部消失;转染效率最高为22.3%;形态学观察及流式细胞仪测定结果显示;Adv-GFP转染的CEF细胞未见细胞病变;多数转染组细胞活力不受影响;说明用Adv-GFP携带外源转染CEF细胞是安全可行的;用脂质体转染试剂转染化学合成的GFP-siRNA;成功地干涉了腺病毒载体介导的GFP基因在鸡胚成纤维细胞的表达;干涉效率为85%;证明了鸡胚成纤维细胞中存在RNAi机制;为进一步利用非复制型腺病毒载体递送siRNA在CEF细胞内进行RNAi的研究奠定了基础.

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。

鸡源禽腺病毒的LMH细胞传代及细胞传代毒株对SPF鸡的致病性

为建立禽腺病毒4型的禽源细胞感染模型,并考察细胞培养毒株对动物的致病性,将实验室2014-2017年间分离的5株血清4型禽腺病毒接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH)并盲传,选取各病毒的LMH细胞培养物,按一定剂量经腿部肌肉注射接种4周龄SPF鸡;记录试验动物的发病情况,剖检采集发病或死亡鸡的脏器并制作病理切片,观察并分析病毒细胞培养物感染SPF鸡的组织病理变化。结果发现:5株血清4型禽腺病毒在LMH细胞上盲传至第4代时开始出现I群禽腺病毒所致的特异性细胞病变,提取培养物中病毒核酸并进行PCR鉴定,均能扩增出大小约564 bp的特异性扩增片段,表明病毒能在LMH细胞上稳定增殖。选取各病毒第10代细胞培养物进行SPF鸡回归试验,发现细胞培养上清接种4周龄SPF鸡后第3天开始,有部分鸡开始精神沉郁,食欲消退、卧地不起瘫痪并迅速死亡,病理剖检及病理组织切片结果显示HB-1、HB-2、HB-3和SD-1毒株保持对4周龄SPF鸡的致病性,病死鸡中能观察到典型的组织病理学变化,而对照组不出现任何临床症状及病理变化。以上结果表明,LMH细胞可用于禽腺病毒增殖传代,是开展禽腺病毒分子致病机制研究的理想细胞模型。

鸡腺病毒的保存与鉴定

本试验对保存的鸡腺病毒进行了鉴定和研究。12株鸡腺病毒在-70℃冻结保存9年后,经过SPF鸡胚肾细胞繁殖复壮2代,加入保护剂进行冷冻干燥制成种毒。12株种毒的病毒TCID50达到了104.0/0.5ml^105.5/0.5ml;其特异性鉴定表明,同型病毒可以被同型抗血清中和,而不能被异型抗血清中和。

鸡腺病毒Ⅰ群血清4型的分离鉴定与防治

<正>鸡Ⅰ群腺病毒(FAV-Ⅰ)为腺病毒科,禽腺病毒属病毒,广泛存在于多种家禽的眼睛、上呼吸道及消化道内,大多数呈隐性感染或与其他疾病共同作用引起家禽发病或死亡[1]。2015年以来在我国北方鸡群内流行一种以心包积液、肝脏肿大出血为特征的疾病,发病率呈上升趋势,经研究证实为腺病毒感染,俗称安卡拉病,也称心包积液综合征。本病毒属于禽腺病毒Ⅰ群血清4型,与包涵体肝炎都属于Ⅰ亚群禽腺病毒。

禽腺病毒人工感染产蛋鸡生殖道器官的病理学观察

用禽腺病毒 EDS_(76)H_(91-1)和 EDS_((?)6)Y_(81)G_4人工感染8只SPF 产蛋鸡和32只伊莎蛋鸡,5天后出现 HI 抗体,第4天后蛋壳颜色变浅,并出现软壳蛋、薄壳蛋、畸形蛋等.在感染后第3～20天内不同时期分别扑杀,取输卵管和卵巢经普通光镜、扫描电镜、透射电镜病理组织学观察,可见卵巢的生殖上皮细胞变性、坏死、核异常,间质有炎性细胞浸润:输卵管粘膜上皮的纤毛变性、坏死,固有层水肿,有较多瘤性细胞浸润;峡部粘膜上皮细胞出现核内包涵体;子宫部的固有层也有较多的炎性细胞,其蛋壳腺有萎缩现象,其结果证实了病毒主要集中在生殖道,输卵管和卵巢是该病毒侵害的主要部位。

一例鸡安卡拉病毒病的临床诊断及综合防控

安卡拉病在山东、河南、江苏、安徽、辽宁、吉林、河北、山西、陕西、湖北、四川等地流行,该病致病原为Ⅰ群禽腺病毒血清4型,不仅危及肉鸡群的安全,在高产蛋鸡、地方鸡种和鸭、鹅群中也出现了感染病例。鸡安卡拉病毒病一年四季均可发生,当鸡遭受严重的应激刺激、外界温度突变等,会导致鸡免疫力降低,对鸡安卡拉病毒易感性增加。

鸡腺病毒内蒙古分离株六邻体蛋白基因片段的合成和分子克隆

根据鸡１０型腺病毒以及人２、５、４０、４１型腺病毒、牛３型、鼠１型腺病毒六邻体蛋白基因序列，选择保守区，设计和合成一对引物，以鸡腺病毒内蒙古分离株基因组ＤＮＡ为模板，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到预期大小的０．５５ｋｂＤＮＡ片段．将此ＤＮＡ片段克隆于ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点，筛选重组质粒，进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测，得到含有六邻体蛋白基因片段的重组质粒。

鸡腺病毒病的发生原因及临床诊治

腺病毒是鸡内在性、条件性病原之一,具有潜在致病力,当鸡群遭到严重应激,特别是存在免疫抑制性因素的情况下多发,且病情严重。本文阐述了鸡腺病毒病的分类、流行情况、病因、临床症状及诊治方法。

两株禽腺病毒人工感染产蛋鸡后脏器组织中病毒分布及其含毒量的检测

分别采用H_(91-1)和Y_(81)G_1两株禽腺病毒通过滴鼻、口服和肌肉注射,人工感染SPF产蛋鸡、伊莎蛋鸡,在感染后第3～20天的不同时期,分别扑杀感染鸡,无菌采集各脏器组织,应用荚心ELISA和血凝(HA)试验检测病料及鸭胚分离病毒。结果表明,H_(91-1)和Y_(81)G_4两株禽腺病毒对SPF蛋鸡和普通蛋鸡的咽喉部、卵巢、输卵管(蛋白分泌部、峡部、子宫部)均有亲嗜性。最早在感染后第3天即能检出病毒,感染后第6～15天检出率最高,输卵管峡部是检测和分离病毒的最佳部位。

表达鸡TRAIL基因的重组5型腺病毒构建

本研究采用RT-PCR从鸡脾细胞扩增到TRAIL基因,测序验证后,将扩增的TRAIL基因开放阅读框克隆到pShuttle-CMV上,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,获得含有TRAIL基因的5型腺病毒重组质粒,进而将PacⅠ线性化重组质粒转染AD-293细胞,收获重组腺病毒。并对后者进行RT-PCR扩增,获得TRAIL基因片段,经westernblot鉴定显示构建的重组腺病毒可表达TRAIL蛋白,表明TRAIL基因在构建的重组腺病毒rAd5-TRAIL中得到表达。本研究为下一步的动物试验和研究TRAIL基因的抑瘤作用奠定了基础。