基于网络药理学与分子对接探究苦虎益母口服液治疗鸡输卵管炎的作用机制

为了探讨苦虎益母口服液治疗鸡输卵管炎的作用机制,试验通过网络药理学和分子对接的方法进行研究。首先筛选TCMSP数据库中苦参、虎杖、黄芪、菟丝子、益母草五味药材的成分和靶点,利用Uniprot数据库对靶标进行规范化处理,利用Cytoscape 3.8.2建立药物-有效活性成分-靶点网络图。由GeneCards、OMIM、CTD数据库收集鸡输卵管炎的靶点。利用微生信在线平台制作鸡输卵管炎和苦虎益母口服液的韦恩图,找到共同靶点。由STRING数据库构建蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络互作图,并通过Cytoscape 3.8.2可视化。再使用DAVID在线工具对重叠靶标进行基因本体(GO)以及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。使用AutoDock Tools软件对核心成分和靶点进行分子对接验证。预测苦虎益母口服液治疗鸡输卵管炎的活性成分有74种,对应靶点77个,1137个鸡输卵管炎靶点,35个共同靶点。PPI网络显示涉及的关键靶点是雌激素受体1(ESR1)、细胞周期调节因子(CCND1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。GO功能富集分析筛选符合伪发现率<0.05的条件后得到相关条目8个。生物过程(biological process,BP)涉及到白细胞介素-18、巨噬细胞活化、免疫反应、细胞对异生刺激的反应、RNA聚合酶II启动子转录正调;细胞组分(cellular component,CC)涉及到细胞外间隙;分子功能(molecular function,MF)涉及到干扰素-γ受体结合、细胞因子。KEGG富集分析表明苦虎益母口服液发挥作用的通路主要有细胞衰老、细胞周期和Toll样受体信号通路。分子对接结果表明苦虎益母口服液有效活性成分槲皮素、山奈酚和木犀草素与关键靶点ESR1、CCND1和VEGFA的结核活性较好,结合能均小于0 kJ/mol。苦虎益母口服液多种有效成分可能作用于多个靶点,通过参与多种信号通路对鸡输卵管炎发挥作用。

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因 (ov)的 5′ 和 3′ 调控区 ,将其克隆入pGEM T载体 ,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体 ,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体 5′ 调控区的下游 ,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡 ,RT PCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达 ,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中 ,仅输卵管膨大部能检测出β 半乳糖苷酶活性 ( 1 1 6 7mU ml) ,注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用 ( 1 5 3 3mU ml) ,重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中 ( 1 7 33mU ml)。结果表明 ,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达 ,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达,并简化质粒DNA的制备过程,本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造,为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区切出,同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体,构建成另一输卵管特异表达载体pOV2;将鸡卵清蛋白基因5′-调控区单独克隆入同样载体,获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性,将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5′-调控区的下游,获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后,经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测,结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达,而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达,而且表达的重组酶能分泌到蛋清中,雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用,其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明,鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点,能用于鸡输卵管生物反应器的研制。

鸡输卵管暂态表达人溶菌酶的研究

目的:建立暂态表达人溶菌酶(hLYZ)的鸡输卵管生物反应器,以寻求一种生产药用hLYZ的有效方法。方法:将hLYZcDNA克隆入鸡输卵管特异表达载体pOV1和pOV2,将获得的重组表达载体pOV1LYZ和pOV2LYZ与一定比例的聚乙烯亚胺混合,经翅静脉注射产蛋鸡,用微球菌平板溶菌试验检测蛋清中的溶菌酶活性。结果:2个重组载体注射鸡的蛋清中均有rhLYZ的表达,pOV2LYZ的表达水平及维持时间优于pOV1LYZ。设立4个试验组,分别以不同剂量或注射次数的pOV2LYZ注射产蛋鸡,蛋清中重组酶的定量测定结果表明,1mg/2次注射组的表达效果较好,最高表达量达750μg/mL蛋清,有效表达维持7d左右,载体注射对鸡的产蛋等生理指标无明显影响。当初次载体注射鸡蛋清中的rhLYZ含量下降到注射前水平时,用同样的方法和剂量进行再次注射。结论:蛋清中的rhLYZ表达水平较初次载体注射有所提高,表达维持时间有所延长。用hLYZ特异抗体进行的Western印迹结果显示,表达在蛋清中的rhLYZ相对分子质量与天然hLYZ相同。

携带猪β干扰素基因的鸡输卵管生物反应器逆转录病毒载体的构建

为构建携带猪β干扰素基因的鸡输卵管生物反应器逆转录病毒载体 ,用PCR技术扩增了猪 β干扰素基因和卵清蛋白5’调控序列 ,然后将其重组到切除了Phsp70启动子的逆转录病毒载体pLNHX中。用酶切和PCR等方法对重组质粒进行鉴定 ,结果表明 ,卵清蛋白 5’调控序列和猪β干扰素基因已正确克隆至逆转录病毒载体pLNHX中。为进一步制备高滴度、高感染性的逆转录病毒 。

人促红细胞生成素鸡输卵管特异表达载体的构建

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出 1 1kb的鸡卵清蛋白 5’端调控区 ,将其亚克隆入pMD18-T载体的多克隆位点 )命名为pOV) ,经酶切和测序鉴定可作为调控序列来启动外源基因的表达。然后从pOV上切下卵清蛋白 5’端调控区 ,再将其亚克隆入pBCE经SalI和HindⅢ双酶切的切口处 ,酶切鉴定为正向插入 ,成功构建了鸡卵清蛋白 5’端调控区调控人促红细胞生成素的质粒表达载体pOV -hEPO 。

H9N2亚型禽流感病毒对鸡输卵管致病性的研究

为了研究H9N2亚型禽流感病毒(H9N2AIV)对鸡输卵管的致病性,本研究首先采用凝集素亲和组化染色法检验了流感病毒受体SAα-2,3Gal在鸡输卵管上的分布;然后用H9N2AIV人工感染产蛋母鸡,制作输卵管的病理组织切片观察其病理变化;最后,采用胶原酶I灌注消化法培养鸡输卵管膨大部的原代上皮细胞,接毒H9N2AIV后观察细胞病变。试验结果表明,鸡输卵管除漏斗部没发现SAα-2,3Gal受体,其余部分均呈强阳性分布;攻毒后病理组织切片观察,输卵管膨大部上皮细胞绒毛脱落,部分细胞坏死、脱落,组织间隙变大,子宫内部组织内部充血出血,其他部分变化不明显;原代细胞接毒72h后,细胞病变不明显,但是上清中HA滴度可以达到3log2。从以上三方面可以看出,鸡输卵管上皮细胞膜上存在禽流感病毒受体,H9N2AIV可以引起侵害鸡输卵管,并引起部分输卵管病变,而且H9N2AIV可以感染鸡输卵管膨大部原代上皮细胞,H9N2AIV有可能通过输卵管感染母鸡。

蛋鸡感染H9N2 AIV后输卵管不同部位病毒的分布及病理组织学观察

为探索H9N2AIV感染蛋鸡致输卵管功能异常的机理,对蛋鸡感染H9N2亚型AIV后输卵管不同部位病毒载量与病理变化进行检测与观察。以H9N2亚型AIV人工感染非免疫蛋鸡,在感染后3、5、7d分别采取鸡输卵管组织,real-time PCR检测感染鸡输卵管组织中AIV病毒载量,同时HE染色后观察病理组织学变化。结果表明,real-time PCR从鸡输卵管膨大部、峡部、子宫部和阴道部均检出了禽流感病毒,其中以膨大部和子宫部病毒载量最高,分别达5.27×104拷贝/μL±3.55×103拷贝/μL和5.52×104拷贝/μL±3.14×103拷贝/μL。组织病理学观察发现蛋鸡感染H9N2亚型AIV后输卵管膨大部、峡部和子宫部病变明显。观察到上皮细胞脱落坏死,炎性细胞浸润腺体,腺体间隙变大甚至溶解,腺体组织充血出血。本研究证实蛋鸡感染H9N2亚型AIV后输卵管组织中AIV病毒载量与其病理变化存在明显的正相关。

鸡输卵管生物反应器的研究进展

随着人们对营养类蛋白、医用类蛋白需求量的增长,建立经济高效的生产技术平台成为转基因动物研究的重要领域,鸡输卵管生物反应器作为转基因鸡重要的应用器官得到越来越多的重视。目前,构建用于携带外源基因的高效表达载体和良好的导入方法是制备能够稳定生产外源基因转基因鸡的关键技术,文章对鸡输卵管生物反应器的研究进展进行了综述,并提出了存在的问题。

蛋鸡感染H9N2 AIV后输卵管不同部位病理组织学观察

对蛋鸡感染H9N2亚型AIV后输卵管不同部位病理变化进行观察,为揭示AIV感染蛋鸡致输卵管功能异常的机理提供实验依据。以H9N2亚型AIV人工感染非免蛋鸡,在感染后3、5、7天分别采取鸡输卵管组织,HE染色观察病理组织学变化。结果发现蛋鸡感染H9N2亚型AIV后输卵管膨大部、峡部和子宫部病变明显。本研究证实蛋鸡感染H9N2亚型AIV后输卵管组织病理变化明显。

含重组人组织激肽释放酶降血压鸡蛋的开发

通过将人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,KLK1)cDNA克隆入自行构建的鸡输卵管特异表达载体pOV中,获得重组载体pOVK经脂质体包裹后,经翅静脉等途径注射产蛋鸡,在收集的鸡蛋蛋清中检测到KLK1活性,表达量高达45U/mL蛋清,有效表达持续7d左右。用含2～4UKLK1的蛋清饲喂高血压大鼠,可使其血压降低70mmHg,5d后回升至饲喂前水平。试验结果表明,在鸡蛋清中表达的重组KLK1口服具有降血压作用,可用于研制降血压保健蛋。

鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法,本研究分别对消化酶、消化时间、取材部位和表面包被物等条件进行比较和优化,筛选出鸡原代输卵管上皮细胞分离和纯化的最佳方法,并对培养细胞进行鉴定与传代。结果显示,取鸡输卵管漏斗部,0.25%胰酶+0.02%EDTA联合消化15min、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,在20%FBS包被的细胞培养瓶中可获得满意的输卵管上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好。培养的细胞在24h时成团贴壁,48~60h明显增殖,呈圆形或多角形'铺路石样'的单层细胞生长,72h后细胞增殖速度减慢,可以维持至10d以上,且传代后细胞贴壁生长良好,经姬姆萨染色和透射电镜观察鉴定为鸡输卵管上皮细胞。本研究建立的鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获得纯度较高的目的细胞,为研究鸭源鸡杆菌对鸡输卵管细胞的侵袭特性提供了良好的体外研究模型。

基于鸡卵清蛋白启动子的纳豆激酶慢病毒表达载体表达特性的研究

纳豆激酶(nattokinase,NK)是一种有效的抗血栓药物。基于已构建的纳豆激酶慢病毒表达载体,旨在比较其在鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞中特异性表达的有效性。提取含卵清蛋白启动子(ovalbumin promoter,OV2)和雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)的pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP重组质粒。通过PCR和双酶切进行初步鉴定,经生物公司测序、包装和滴定得转染传代培养的鸡输卵管上皮细胞和鸡胚成纤维细胞,并采用荧光显微镜和qPCR法检测细胞表达产物。结果表明,载体pLV-OV2-ERE-NK-2A-EGFP构建成功;且荧光显微镜下,鸡输卵管上皮细胞的绿色荧光多于成纤维细胞;qPCR检测发现 NK 正常表达。提示成功构建纳豆激酶慢病毒表达载体且在鸡输卵管上皮细胞中正常表达。

重组人组织激肽释放酶与猪胰腺组织激肽释放酶的理化特性比较

为了研究表达在蛋清中的重组人组织激肽释放酶（rhK1）是否与天然组织激肽释放酶具有相似的理化特性，对鸡输卵管暂态生物反应器表达的rhK1与猪胰腺组织激肽释放酶（pK）的理化特性进行比较鉴定．Western blotting检测结果显示，表达在蛋清中的rhK1能被人组织激肽释放酶（hK1）特异抗体识别，与pK无交叉反应，rhK1酶原和成熟酶的分子量约为43kDa和37kDa．理化鉴定结果显示，rhK1在pH7～10的范围内活性稳定，而pK在pH8～9的范围内活性较稳定；rhK1和pK均能被Cu^2＋、Fe^3＋和Al^3＋完全抑制；rhK1和pK的热稳定性相似，但rhK1在37℃孵育20min后被显著激活、以上试验结果表明，表达在蛋清中的rhK1分子量正确，理化特性与猪的天然酶相似，具有开发利用价值．

含重组人组织激肽释放酶降血压牛奶的开发

人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,KLK1)具有降血压和肾脏损伤修复等广泛的生物学作用,在心血管疾病防治方面具有广阔的应用前景.我们将KLK1cDNA克隆入自行构建的鸡输卵管特异表达载体pOV中,获得的重组载体pOV KLK1经脂质体包裹后,经翅静脉等途径注射产蛋鸡,在收集的鸡蛋蛋清中检测到KLK1活性,表达量高达45U/ml蛋清,有效表达持续7天左右.用含2～4U KLK1的蛋清饲喂高血压大鼠,可使其血压降低70mmHg,5天后回升至饲喂前水平.这些试验结果表明,表达在鸡蛋清中的重组KLK1具有产业化开发价值,由于口服具有降血压作用,所以不需纯化即可添加在牛奶中制成降血压牛奶.