鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因 (ov)的 5′ 和 3′ 调控区 ,将其克隆入pGEM T载体 ,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体 ,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体 5′ 调控区的下游 ,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡 ,RT PCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达 ,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中 ,仅输卵管膨大部能检测出β 半乳糖苷酶活性 ( 1 1 6 7mU ml) ,注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用 ( 1 5 3 3mU ml) ,重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中 ( 1 7 33mU ml)。结果表明 ,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达 ,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达,并简化质粒DNA的制备过程,本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造,为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5′-和3′-调控区切出,同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体,构建成另一输卵管特异表达载体pOV2;将鸡卵清蛋白基因5′-调控区单独克隆入同样载体,获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性,将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5′-调控区的下游,获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后,经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测,结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达,而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达,而且表达的重组酶能分泌到蛋清中,雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用,其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明,鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点,能用于鸡输卵管生物反应器的研制。

含重组人组织激肽释放酶降血压鸡蛋的开发

通过将人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,KLK1)cDNA克隆入自行构建的鸡输卵管特异表达载体pOV中,获得重组载体pOVK经脂质体包裹后,经翅静脉等途径注射产蛋鸡,在收集的鸡蛋蛋清中检测到KLK1活性,表达量高达45U/mL蛋清,有效表达持续7d左右。用含2～4UKLK1的蛋清饲喂高血压大鼠,可使其血压降低70mmHg,5d后回升至饲喂前水平。试验结果表明,在鸡蛋清中表达的重组KLK1口服具有降血压作用,可用于研制降血压保健蛋。

含重组人组织激肽释放酶降血压牛奶的开发

人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,KLK1)具有降血压和肾脏损伤修复等广泛的生物学作用,在心血管疾病防治方面具有广阔的应用前景.我们将KLK1cDNA克隆入自行构建的鸡输卵管特异表达载体pOV中,获得的重组载体pOV KLK1经脂质体包裹后,经翅静脉等途径注射产蛋鸡,在收集的鸡蛋蛋清中检测到KLK1活性,表达量高达45U/ml蛋清,有效表达持续7天左右.用含2～4U KLK1的蛋清饲喂高血压大鼠,可使其血压降低70mmHg,5天后回升至饲喂前水平.这些试验结果表明,表达在鸡蛋清中的重组KLK1具有产业化开发价值,由于口服具有降血压作用,所以不需纯化即可添加在牛奶中制成降血压牛奶.