血清Ⅱ型鸡马立克氏病毒的分离鉴定及SW14分离株pp24基因的序列分析

为了解鸡马立克氏病毒(MDV)在我国鸡群中的流行情况,本研究于2021年从福建省已免疫鸡马立克氏病(MD)疫苗鸡群且发生疑似MD病例的鸡场采集21份疑似发病蛋鸡外周血,分离其淋巴细胞接种鸡胚成纤维细胞(CEF),5 d后收集病毒,盲传1~2代后获得21株能够形成典型MDV蚀斑的分离株,依次命名SW1~SW21,采用PCR分别扩增MDV血清Ⅰ型(MDV-1) Meq基因、Ⅱ型(MDV-2) ORF873基因、Ⅲ型(MDV-3) US3基因进行MDV分型鉴定,扩增鸡传染性贫血病毒(CAV) VP3基因、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV) LTR基因、禽白血病病毒A亚群(ALV-A)、B亚群(ALV-B)、J亚群(ALV-J)的env基因进行外源病毒检测,结果显示MDV-1均为阴性,MDV-2均为阳性,MDV-3阳性率为38.1%(8/21),未检测到外源病毒基因。在MDV-2分离株中选择SW14株进行pp24基因的PCR扩增,测序后与MDV-2参考株SB-1、301B/1、HPRS24的pp24基因进行基因序列比对分析,结果显示,SW14和SB-1株同源性(96.3%)最高。通过透射电镜观察SW14,可见分离株呈双环型,直径约110 nm,符合MDV病毒粒子形态特征。本研究证实该鸡场中存在MDV-2流行,可能会影响疫苗的免疫效果,但其致病性有待进一步研究。本研究从疑似发病蛋鸡中分离到新的MDV-2株,为我国MDV-2的研究提供重要参考依据,同时为我国MD疫情防控提供有价值的研究材料。

二烯丙基二硫化物体内抗鸡马立克氏病毒的研究

为探究大蒜中抗病毒的活性成分二烯丙基二硫化物(Diallyl disulfide,DADS)在体内抗鸡马立克氏病毒(Marek's Disease Virus,MDV)的效果,以弱毒疫苗株CVI988/Rispens接种鸡胚成纤维细胞(CEFS)获取大量的MDV,感染雏鸡建立模型。主要通过病理组织切片的观察、血清生化指标的检测以及实时荧光定量QPCR等方法,探讨DADS在鸡体内抗鸡马立克氏病毒的有效浓度范围以及作用效果。结果表明:DADS浓度为250,500,750μmol/m L时能有效降低雏鸡血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及甘油三酯(TG)的水平,同时也有降低病毒拷贝数的作用。所以3种浓度的DADS能在疾病早期有效抑制患马立克氏病鸡肝脏肿瘤生长并具有体内抗病毒的效果。

鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

为构建全基因组鸡马立克氏病病毒814株感染性细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC),首先通过构建表达Eco-gpt(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase,XGPRT,gpt)的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1-3 kb)和带有细菌人工染色体的基本功能基因序列的鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11,将重组病毒转移载体与鸡马立克氏病病毒细胞总DNA共转染鸡胚成纤维细胞,在选择培养基中经过8轮加压筛选,获得并纯化重组病毒;将重组病毒细胞总DNA电转化大肠杆菌,筛选共获得38个BAC分子克隆化病毒,提取BAC-DNA转染鸡胚成纤维细胞以拯救重组病毒。结果表明,MDV-BAC2 DNA再次启动病毒感染,拯救了重组鸡马立克氏病病毒。成功构建了鸡马立克氏病病毒814株基因组全长感染性细菌人工染色体,为方便利用现代RED/ET基因重组系统对病毒进行反向遗传操作提供了技术平台;同时为研究鸡马立克氏病病毒的基因功能和开发新型马立克氏病疫苗奠定了基础。

鸡马立克氏病毒UL36^(USP)的pTYB1表达载体的构建及表达分析

UL36USP是马立克氏病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段(UL36USP),为获取无冗余氨基酸残基的纯净UL36USP蛋白。试验采用p TYB1表达载体与目的基因UL36USP构建重组表达质粒,并诱导融合蛋白表达,在含有还原剂DTT的缓冲液中利用Intein发挥内含肽的剪切活性,将UL36USP从融合蛋白上分离出来,实现目的蛋白UL36USP的单柱纯化,纯化后的蛋白不带有冗余的氨基酸残基,并利用UL36和Intein的特异性抗体进行了Western Blot鉴定。该研究尝试了一种能有利于难表达蛋白的可溶性表达的方法,并利用Intein标签的剪切活性分离产生纯净的目的蛋白,如一些难表达的病毒蛋白,为抗病毒和抗肿瘤疫苗的研究提供材料。

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB。体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达。用pcDNA3-gB对AA肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免。间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次。之后2周攻毒,观察免疫保护效果。结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72.2％。

禽源U6启动子介导鸡马立克氏病病毒gI、gE基因特异siRNA的筛选及干扰活性鉴定

为筛选鸡马立克氏病病毒(MDV)gI、gE基因特异性siRNA,本研究以鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA为模板,扩增禽源cU6-3启动子序列,并合成针对gI和gE基因各5个靶位点的10条shRNA序列。通过重叠PCR将cU6-3启动子与shRNA融合扩增制备shRNA表达盒,将制备的shRNA表达盒分别与重组质粒pEGFP-gI或pEGFP-gE共转染CEF细胞,并根据荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果评价siRNA抑制融合荧光蛋白表达的效率。结果表明,gI和gE基因的抑制效率为10%～80%。分别将其中抑制效率最高的一条shRNA插入pGEM-T载体中构建重组表达质粒pcU6-shgI735和pcU6-shgE936,通过不同细胞系稳定干扰试验和抑制病毒复制试验评价其干扰活性。结果显示,pcU6-shgI735和pcU6-shgE936能够明显抑制融合蛋白的表达及MDV在CEF细胞中的增殖,并且禽源U6启动子构建的表达盒在禽源细胞(DF1)中的活性比在哺乳动物细胞(Vero、MDCK)的活性高1.21～1.45倍。本研究鉴定获得了gI和gE基因的特异性siRNA,筛选出能够抑制MDV复制的靶位点,为MDV基因的功能和抗MDV病毒研究奠定了基础。

鸡马立克氏病病毒细菌人工染色体技术展望

鸡马立克氏病病毒反向遗传操纵技术的发展促进了对其生物学特性研究的不断深入,文章回顾了MDV基因操纵技术的发展历程,综述了MDV细菌人工染色体的特点、构建策略、研究进展、应用局限性及未来发展潜力。

病毒保护剂在鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗生产中的应用

2种不同的病毒保护剂A和B,应用于鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗生产中,3批试验结果表明:裂解后SPGA4万倍稀释,保护剂B的蚀斑数比对照平均增加121%,保护剂A最低使减少14%。保护剂B的最佳添加浓度筛选试验结果表明:1次添加浓度为1%或2%,2次添加浓度为2%。3批病毒保护剂B扩大中试试验结果表明:裂解后SPGA4万倍稀释,试验组比对照组蚀斑数平均增加66.5%。HVT活疫苗(病毒保护剂B)特异性试验结果表明,马立克氏病标准阳性血清对其特异性识别;平行冻干后,试验组比对照组蚀斑数高200%;经37℃10d耐热试验表明,试验组比对照组蚀斑数高242%;试验苗免疫攻毒保护率为75%,对照苗为33.4%。

鸡马立克氏病病毒基因及基因工程疫苗的研究进展

鸡马立克氏病是当今对养鸡业危害最大的疫病之一,加强对该病的防控和减少因此而导致的损失是当前面临的重要课题。随着生物技术的快速发展,对MDV基因和蛋白结构功能的研究取得可喜的进展,也为基因工程疫苗的研究提供了方向。

人参皂苷Rg3体内抗马立克氏病毒的作用

为探讨人参皂苷Rg3对马立克氏病毒感染的防治效果,采用马立克氏病毒人工感染雏鸡模型,通过人参皂苷Rg3口服途径,并应用发病率、保护率、平均存活日龄等指标来评价了药物对机体的保护作用。结果表明,人参皂苷Rg3可明显降低试验鸡的发病率与肿瘤检出率,能保护感染鸡的免疫器官,增强了感染鸡的免疫力,具有抗病毒作用。

鸡马立克氏病病毒LMS分离株基因组重复区的测定及分析

为分析鸡马立克氏病病毒(MDV)LMS分离株的分子遗传特性,本研究对该分离株基因组重复区(包括连接长重复区和短重复区的α样序列)进行了测定。LMS分离株基因组的长重复区为11 746 bp,α样序列为997 bp,短重复区为12 431 bp。在重复区内,预测存在43个ORF,与参考病毒株序列相比存在5个变异较大的ORF。重复区的遗传进化分析表明,LMS分离株与国内814株和欧洲pC12-130株亲缘关系较近。LMS分离株在短重复区潜伏相关转录本(LATs)编码序列的预测转录起始位点位置存在缺失;LMS分离株在α样序列内存在一个新的短重复序列。

鸡马立克氏病病毒编码的miRNA体内表达特征分析

最新研究发现,鸡马立克氏病病毒(MDV)基因组编码的miRNAs在肿瘤发生发展中发挥了重要的调控作用。为阐明强弱毒株编码的miRNA差异表达与病毒复制的关系,本研究采用SYBR Green荧光定量PCR方法检测了MDV CVI988疫苗株和MDV GA强毒株编码的M4-5P、M8-3P和M12-3P 3种miRNAs在肝脏和胸腺中的动态表达特征。结果表明,强弱毒株编码的这3种miRNAs在病毒感染过程中具有明显的差异性,其中GA株编码的miRNAs表达量高于CVI988株,这是由于强弱毒株在体内的复制滴度差异造成的,表明在感染前期miRNAs的表达量与病毒载量有关。该研究为进一步研究miRNAs的功能提供了实验依据。

特超强毒648株马立克氏病病毒的囊膜糖蛋白gE基因的克隆和序列比较

鸡马立克氏病毒特超强毒 (vv+MDV) 648株的囊膜糖蛋白 gE基因经PCR扩增并克隆入pUC1 8载体。 648株gE基因经核酸序列分析测定 ,全长为 1 494碱基。所编码的蛋白具有跨膜糖蛋白的一些特征。它含有 8个潜在的糖基化位点、N端有一段疏水区 (1～ 1 9aa)所构成的信号肽、C端有一段疏水区 (391～ 41 9aa)所构成的膜锚着序列。经 648株 (vv+MDV)和马立克氏病毒强毒 (vMDV)GA株的 gE相比较 ,在MDV血清 1型中 gE是较为保守的 ,二者仅有 2个核苷酸的差异 (第 51 2位、第 1 472位 ) ,并导致了有二个相应的氨基酸的改变 (第1 71位Leu/Pro、第 491位Arg/Lys)。

鸡马立克氏病病毒变化趋势与免疫失败原因

对于鸡马立克氏病还没有有效的治疗药物,主要依靠疫苗预防,但是由于免疫程序不科学、毒株毒力增强等原因,会出现免疫失败的情况。该文对近年鸡马立克氏病病毒变化趋势及免疫失败原因进行分析。

鸡马立克氏病的病原、诊断与防制

1病原特点 鸡马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒引起的鸡淋巴细胞增生性肿瘤疾病。鸡马立克氏病病毒（MDV）属于疱疹病毒科。病毒在鸡体内有完整病毒、裸体病毒和综合型病毒三种存在形式。完整病毒，即带囊膜的病毒，主要存在于鸡羽毛囊上皮细胞，抵抗力很强，可随脱落的羽毛囊上皮细胞散播于外界，是造成本病传播的主要因素。裸体病毒，即没有囊膜的病毒，存在于大多数感染细胞内，抵抗力很弱，一旦其所在细胞死亡，病毒很快死亡，所以又称之为细胞结合型病毒。整合型病毒，病毒仅以核酸的形式整合到宿主细胞的染色体中，这种病毒形式存在于某些感染细胞内和肿瘤细胞中，病毒随细胞存亡。

蛋鸡内脏型马立克氏病的诊治

鸡马立克氏病（MD）是最常见的一种鸡淋巴组织增生性疾病，以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器肌肉和皮肤的单核性细胞浸润为特征。本病由一种疱疹病毒引起，传染性强。MD存在于世界所有养禽国家和地区，其危害随着养鸡业的集约化而增大。疫苗免疫失败屡有发生，受害鸡群的损失在1％～3％不等，个别的鸡群可达50％以上。近年来世界各地相继发现毒力极强的鸡马立克氏病病毒，给本病的防治带来了新的问题。现将近期一典型病历的诊治情况总结如下。

鸡马立克氏病的流行与免疫

鸡马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒引起的鸡淋巴细胞增生性肿瘤疾病。其特点是在鸡外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤出现淋巴样细胞、单核细胞的浸润和增生及肿瘤的形成。鸡马立克氏病病毒（MDV）归属于疱疹病毒科。MDV在流行过程中经常出现变异毒株，其共同特点是毒力比一般毒株强，有极强的肿瘤性，用HVT免疫的鸡不能阻止其致瘤性。MDV分3个型，Ⅰ型为致病性强毒株及其致弱毒株，Ⅱ型为无致病性的自然弱毒株，Ⅲ型为火鸡疱疹病毒（HVT），此型病毒本非MDV，但因与鸡马立克氏病关系密切，故将其划分在马立克氏病毒型内。

马立克氏病液氮疫苗介绍

鸡马立克氏病病毒不易被杀灭是由于感染马立克氏病病毒的阳性鸡终生排毒。使用疫苗是预防该病的有效方法，而目前最有效的是CVI988/Rispens液氮苗。