鸡黄病毒CJD05株E基因克隆与序列分析

为了解福建省鸡黄病毒(CFV)CJD05株来源及其遗传进化关系,根据鸭黄病毒(DFV)BYD-1株E基因全序列设计合成1对引物,特异性扩增CFV CJD05株的E基因,并对其序列进行分析。结果表明克隆获得CFV CJD05株1 503 bp的E基因特异性目的条带,同源性分析表明CFV CJD05株E基因核苷酸序列与DFVBYD-1株、鹅黄病毒(GFV)JS804株的同源性分别为99.2%、99.3%,氨基酸的同源性分别为99.0%、98.6%,表明CFV CJD05株、DFV BYD-1株和GFV JS804株高度同源,与坦布苏病毒(TBSV)的同源性高于其它虫媒介黄病毒。

鸡黄病毒RT-PCR检测方法的建立

为建立鸡黄病毒(CFV)分子生物学检测方法,本研究以虫媒介黄病毒基因3'末端通用引物EMF1/VD8作为鉴别引物,以CFV分离株CJD-05为模板,建立了检测CFV的RT-PCR方法。RT-PCR扩增产物测序结果显示,其扩增片段为708 bp,而该方法对其它禽类病毒病原核酸的扩增结果均为阴性,表明该方法具有较高的特异性。扩增的特异性片段与GenBank中CFV、鸭黄病毒和鹅黄病毒序列同源性达到100%、98%和99%。对参考病毒进行梯度稀释检测,该方法检测CFV的敏感度可达10-3TCID50/0.1 mL。采用所建立的RT-PCR方法对2009年福建省部分鸡场的112份临床样品进行检测,结果显示37份为CFV阳性。本研究建立的RT-PCR方法可以作为CFV在临床检测和分子流行病学调查的一种检测方法。

检测鸡黄病毒血清抗体间接ELISA方法的建立与应用

本研究以鸡黄病毒FQ-C1株为包被抗原,建立检测鸡黄病毒血清抗体的间接ELISA方法。经优化后确定其最佳工作条件为每孔包被抗原0.57μg,血清以1:640倍稀释,羊抗鸡IgG酶标抗体以1:3200稀释,显色10 min后读取OD450值,P/N值≥2.1的血清为阳性。本实验所建立的诊断方法敏感性高于血清中和试验。对849份来自福建的血清样品进行检测表明,鸡黄病毒的血清阳性率达33.1%,说明鸡黄病毒感染有一定的流行性。

鸡黄病毒灭活疫苗的研制及免疫效果研究

鸡黄病毒FQ-C1株经SPF鸡胚连续传40代后,检测其尿囊液毒的ELD50达到1×10-4.33/0.1 mL。将该病毒第40代SPF鸡胚液毒灭活后制备成油乳剂灭活疫苗。SPF雏鸡和蛋鸡安全性试验表明,该疫苗的安全性好,无不良影响。以该疫苗一次单剂量(1 mL/只)免疫开产蛋鸡,28 d后攻以鸡黄病毒强毒测定疫苗的保护效果,结果显示疫苗免疫组较未免疫组蛋鸡的产蛋率高出75.8%,产蛋保护率达93.2%以上。试验表明,本研究制备的鸡黄病毒灭活疫苗安全性好,且具有良好的免疫原性,免疫后可有效抵抗鸡黄病毒所致的产蛋骤降。

一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定

从蛋鸡临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、卵泡膜出血为主要特征的发病蛋鸡的卵巢、输卵管、肝、脾等组织中分离到3株病毒。分离毒能致死番鸭胚和鸡胚,人工感染产蛋期的蛋鸡能导致蛋鸡产蛋急速下降,卵泡出血和萎缩,并能从人工感染病鸡中回收到病毒;分离毒不能凝集鸡和鸽红细胞,并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR或IFA结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、鸡减蛋下降综合症病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和小鹅瘟病毒;用黄病毒特异引物扩增为阳性,序列测定与分析显示分离毒5′末端部分核苷酸与黄病毒属的巴格扎病毒同源性为70%,与国内鸭源黄病毒核苷酸同源性达99%;3′末端部分核苷酸序列与巴格扎病毒同源性为75%,与坦布苏病毒的同源性达91%,与国内鸭源黄病毒的同源性达99%。上述结果提示分离毒是黄病毒科黄病毒属的一个新成员,是导致蛋鸡产蛋下降的病原。

鸡源黄病毒卵黄抗体间接ELISA检测方法的建立

为在检测产蛋鸡黄病毒抗体水平过程中减少应激,以鸡源黄病毒FQ-C1株为包被抗原,建立检测鸡源黄病毒卵黄抗体的间接ELISA方法。确定的优化条件是包被抗原浓度为5.7ng.μL-1,卵黄抗体以1∶160倍稀释,羊抗鸡IgG酶标抗体以1∶3 200稀释。经特异性、敏感性检验表明该方法特异性强、敏感性高,适合于产蛋鸡免疫后的抗体检测。