鸡IBV中国流行毒株的分子变异及其DNA疫苗的研究

中国农科院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室江国托博士等人承担的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)遗传变异分析项目,取得了阶段性新进展。该研究从我国华东等六大地区分离并鉴定了30株IBv流行株;分析了不同地区流行毒株的血清型;

用血清学方法检测肉鸡IBV抗体

将带有传染性支气管炎（IB）母源抗体的肉鸡分为1日龄用H120喷雾免疫和不免疫2组,然后在28日龄用4种不同血清型IBV中的任何一种攻毒,分别在不同时间采血,用琼脂凝胶沉淀试验（AGP）、血凝抑制试验（HI）、ELISA和病毒中和试验（VN）进行抗体测定。结果表明,AGP检测到短暂的抗体应答,特异性100％,敏感性约40％,ELISA试验非免疫肉鸡的血清抗体呈中度敏感性和高度特异性,而对免疫肉鸡则呈高度敏感性,特异性不一。HI试验的特异性为55％—100％,而敏感性差异很大。VN对免疫肉鸡的敏感性为20％—100％,特异性取决于选定的判定标准。免疫肉鸡的HI。

鸡IBV的分子学血清型鉴别方法的修改与利用

美国M.W.Jackwood等开发一种逆转录酶多聚酶链反应（RT-PCR）诊断鸡传染性支气管炎病毒IBV,用限制性片段长度多态性分析（RFLP）可快速鉴别病毒的血清型。简单地说,把蛋中生长的病毒RNA提取并纯化,完整S1基因进行扩增,对PCR产物用限制性内切酶消化和电泳来确定血清型。他们对这种RT-PCR/RFLP又作三个步骤修改。首先,病毒S1

抗鸡传染性支气管炎病毒中药的筛选

【目的】对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)进行抗病毒中药的筛选,并验证其治疗效果,为临床用药提供一定参考。【方法】采用鸡胚培养法,通过预防和治疗2个角度对24味单一中药、6种市售复方中药进行抗IBV的有效成分或方剂筛选试验,即在SPF鸡胚中先注射中药2 h后再接种病毒和先接种病毒2 h后再注射中药。使用SPSS 20.0软件对鸡胚重量进行方差分析,利用实时荧光定量PCR法辅助判定治疗效果。【结果】对鸡胚净重进行方差分析显示,桔梗组与阳性对照组差异显著(P<0.05),与阴性对照组差异不显著(P>0.05),表明预防和治疗均有效果。实时荧光定量PCR检测鸡胚尿囊液病毒滴度结果显示,桔梗、鱼腥草、宣肺败毒方、绞股蓝、蒲公英、甘草对IBV增殖均有抑制作用,其中桔梗抑制效果最佳。【结论】桔梗对IBV有显著的预防及抑制效果,结果为深入研究桔梗作用机理提供了依据。

鸡肾型IBV分离株M基因的克隆与特性分析

依据NCBI所登录的鸡传染性支气管炎病毒的M基因序列设计了一对引物,应用TRIzol试剂盒对8个肾型鸡传染性支气管炎病毒陕西地方分离株进行总RNA的提取,以所得到的RNA为模板,用RT-PCR对M基因进行扩增;其目的条带回收提纯后,与PMD18-T克隆载体进行连接,转化到DH5α宿主菌,并经药物抗性筛选、PCR及酶切鉴定,将所筛选鉴定出的阳性质粒进行测序,最后对测序结果进行分析。结果表明:陕西地方8个毒株(BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG)M基因长约为650 bp,其中YX、WH株本身无BamH 1酶切位点。WH与其它分离株的核苷酸同源性为91.8%～92.6%,而其它的分离株间的同源性为98.8%～99.8%。8个毒株与参考株的核苷酸同源性为74.9%～99.8%。其N端90 aa肽段与对照株相比,不同之处表现为高亲水性氨基酸取代低亲水性氨基酸,这会使其具有更好的抗原性。

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)ZZ2004株核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核衣壳蛋白(N)。根据IBV ZZ2004株的N基因设计1对引物,提取IBV ZZ2004株的RNA,利用RT-PCR技术扩增大小约1.23kb的片段,将其插入克隆载体pGEM-T构建pGEMT-N。将pGEM-T-N用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pGEX-6P-1,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳,结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白;Western blotting检测结果显示N蛋白可与相应的IBV ZZ2004阳性血清发生特异性反应,结果表明N蛋白有一定的生物活性。本研究为IBV诊断试剂盒及新型IBV重组亚单位疫苗研制奠定基础。

板蓝根和黄芪提取液与IBV感作后对鸡胚EE值和EE指数的影响

为研究板蓝根和黄芪复方提取液对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)致鸡胚矮小化的影响,将IBV分别与不同浓度提取液感作后接种于9日龄鸡胚。孵育,分别测定接种病毒、药液和病毒与药液混合液后48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h鸡胚的体重与卵重的比值(EE值)和试验组EE值与空白对照组平均EE值的比值(EE指数)的变化。结果表明,浓度为1.00 g/ml、0.50 g/ml的板蓝根和黄芪提取液对IBV致鸡胚矮小化具有显著的抑制作用。

不同IBV疫苗免疫鸡感染GVI-1型毒株后固有免疫相关基因的表达差异研究

本试验选取国内常用的IBV两个商品化疫苗株(H120和4/91)及在西南地区分离到的GVI-1型IBV分离株(ZQX株)作为研究对象,进行动物免疫攻毒试验,测定不同时间固有免疫相关基因的表达变化,从天然免疫角度对两个疫苗株的免疫机理进行分析,为IBV的免疫机理和GVI-1型毒株的致病机理提供参考。结果显示:疫苗株H120和4/91对ZQX都有一定的保护作用;所选取的5个目的基因(MDA5、TLR3、TLR7、IFN-β、IL-6)在抵御IBV ZQX感染中都发挥了一定的作用,但MDA5和TLR3发挥的作用更为显著;H120免疫组感染ZQX后,固有免疫相关基因的表达比4/91免疫组更为迅速。

鸡传染性支气管炎病毒W株膜蛋白基因的分子特征

【目的】研究鸡传染性支气管炎病毒（IBV）W侏膜蛋白基因的分子特征。【方法】根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒M基因序列，设计并合成1对特异性引物，利用RT-PCR技术成功扩增了IBV河南地方分离毒株W株M基因全长片段，然后进行克隆、测序，并与GenBank中发表的11株国内外参考毒株进行比较分析。【结果】获得的W株M基因全长为681bp，编码M蛋白226个氨基酸残基，其N端的前60nt为前导序列，近N端含有2个潜在的N-糖基化位点；3个跨膜区域分别位于21-37，45～68，74～94aa处，在171～176，183～193aa处有2个潜在的抗原位点，且M蛋白上有9个高度保守的半胱氨酸；与参考毒株相比，IBV-W株M基因的核苷酸同源性为88．2％～92．7％，推导的氨基酸同源性为91．1％～95．67％；M蛋白的突变主要发生在前16位氨基酸，其中第2位缺失1个氨基酸，第3～6位连续插入4个氨基酸，第8～9位缺失2个氨基酸，第14～16位的3个氨基酸发生连续突变，其他位点的氨基酸变异为点突变，M蛋白核苷酸序列的变异主要表现为静默突变，亲水区较疏水区更易变易；在系统发生进化树中，W株与BJ株处于同一个小的分支上，亲缘关系较近，而与其他参考株的亲缘关系较远。【结论】推测W株可能是一个新的变异株。

一株鸡传染性支气管炎病毒的鉴定及S1基因序列分析

将分离到的一株疑似鸡传染性支气管炎病毒接种SPF鸡胚增殖,通过致鸡胚矮小化试验、红细胞凝集试验、对新城疫病毒增殖干扰试验、动物回归试验及RT-PCR分子鉴定,结果证实该病毒为鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。应用MEGA5分析软件,与Gen Bank上IBV常见疫苗株、流行毒株和部分参考株进行序列比对,其S1基因序列与近年来我国流行毒株同源性较高,为95%~99%,与传统疫苗株H120、H52、M41和W93同源性较低,仅为77%~79%。

鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及序列分析

根据 IBV病毒的已报道基因序列设计了一对可扩增 N基因片段的引物 ,并得到了预期的 43 8bp长的扩增产物 ;将目的条带纯化并回收以后 ,克隆到 p MD1 8-T质粒载体中 ,对插入片段进行序列测定 ,并与已发表的 IBV N基因序列进行了比较和分析 ,证明扩增产物是正确的 ,从而建立起了一种准确、实用的检测、鉴定 IBV方法。

鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)主要侵害鸡的呼吸系统和泌尿生殖系统,可以引起鸡的呼吸道症状、肾脏损害、产蛋量和蛋的品质下降。该病毒血清型较多,容易产生变异,给疫病防控带来很大困难。主要对近年来在IBV的基因组结构、IBV的复制过程、IBV的结构蛋白及生物学功能、IBV的变异机制、IBV的进化以及IBV的鉴定和检测等方面的研究进展进行综述,以期为更加深入地认识和研究该病毒提供参考。

鸡传染性支气管炎病毒SYBR Green Ⅰ Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,试验以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了IBV SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR检测方法对其进行研究。结果表明:该检测方法的标准曲线线性关系良好,相关系数(R2)为0.998 8,可检测到7.5×103copies/μL的病毒核酸,与其他禽源病毒不发生交叉反应,重复性试验变异系数小于3%。说明该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可用于IBV的定量检测。

鸡传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的血清学方法,本试验以IBV为检测抗原,建立了一种检测IBV抗体的间接ELISA方法,并对各种检测条件进行了优化。研究结果显示,抗原的最佳包被浓度为19.2μg/mL,最佳包被条件为37℃1h后4℃过夜;血清的最佳稀释度为1∶800,37℃孵育60min;酶标二抗稀释度为1∶7 000,37℃孵育60min;底物显色为37℃避光作用10min。经特异性、重复性、敏感性试验证明,该方法与鸡常见病原的阳性血清均无交叉反应,重复性较好及血清稀释至1∶12 800时仍可检测到IBV抗体。结果表明,本试验所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。

鸡传染性支气管炎病毒强毒株和弱毒疫苗株的免疫磁珠-多重RT-PCR鉴别方法的建立

利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)多克隆抗体构建的免疫磁珠富集IBV,对Gen Bank中896株IBV S1基因序列及其多变区进行分析,根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物,建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RT-PCR方法。结果表明:该方法能扩增出强毒株约710 bp的通用片段和约350 bp的特异片段,弱毒疫苗株能扩增出约710 bp的通用片段和约210 bp的特异片段,能鉴别出强毒株和弱毒疫苗株。免疫磁珠富集IBV后比不富集病毒用RT-PCR方法检测敏感性提高100倍。该方法为IBV检测提供了新的技术支持。

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。

传染性支气管炎N基因克隆及在大肠杆菌中的可溶性表达

核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据GenBank报道的IBV的M41株的N基因序列设计一对引物,从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术扩增获得了约1.23kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD18-T,经测定核苷酸序列证实N基因扩增正确,表明已成功构建pMD18-T-N。再将pMD18-T-N用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌Rossetta中,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白,Western-blotting检测表明N蛋白可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应,表明N蛋白有一定的生物活性,可为用于生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础。

鸡传染性支气管炎病毒GZ株的分离鉴定及3CL^(pro)基因片段序列分析

从福建某鸡场发病鸡的气管和肾脏组织中分离到1株病毒,通过病毒对SPF鸡胚的致病性特征、血凝特性、电镜观察及RT-PCR鉴定等方面的研究,证实该病毒为鸡传染性支气管炎病毒(IBV),并命名为GZ毒株。通过RT-PCR对该毒株的3CLpro基因片段进行扩增,随后进行克隆与测序。该序列与参考毒株的核苷酸序列分析显示,GZ株的3CLpro基因片段与参考毒株的同源性为85.9%~98.5%,与Beaudette毒株核苷酸序列同源性最高(98.5%),而与H120株同源性为89.7%,与LX4株同源性最低(85.9%)。遗传演化分析显示,GZ分离株与参考株可以划分为3个群,GZ分离株与Beaudette毒株处于同一分支,而与LX4、BJ及Massachusetts毒株亲缘关系较远。