鸦胆子苦醇调节SPHK1/S1P/S1PR3信号通路对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨鸦胆子苦醇调节鞘氨醇激酶1(SPHK1)/鞘氨醇-1-磷酸(S1P)/鞘氨醇-1-磷酸酯受体3(S1PR3)信号通路对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。方法将体外培养的人卵巢癌细胞株SKOV-3随机分为对照组、鸦胆子苦醇组、SPHK1过表达组、鸦胆子苦醇+空载组、鸦胆子苦醇+SPHK1过表达组,检测各组细胞活力、克隆形成率、迁移数、侵袭数、凋亡率以及增殖相关蛋白[骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(C-myc)]、凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、上皮间质转化(EMT)相关蛋白[上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)]及SPHK1、S1P、S1PR3蛋白表达量。采用SKOV-3细胞构建裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组、鸦胆子苦醇低剂量组、鸦胆子苦醇中剂量组、鸦胆子苦醇高剂量组、SPHK1过表达组、鸦胆子苦醇高剂量+空载组、鸦胆子苦醇高剂量+SPHK1过表达组,检测各组移植瘤生长情况;随机分为对照组、鸦胆子苦醇组、SPHK1过表达组、鸦胆子苦醇+空载组、鸦胆子苦醇+SPHK1过表达组,检测各组移植瘤组织中增殖、凋亡、EMT及SPHK1/S1P/S1PR3信号通路相关蛋白表达量。结果体外实验显示,与对照组相比,鸦胆子苦醇组细胞活力、克隆形成率、迁移数、侵袭数和C-myc、Bcl-2、Ncadherin、SPHK1、S1P、S1PR3蛋白表达量均显著降低(P<0.05),凋亡率和Bax、E-cadherin蛋白表达量均显著升高(P<0.05);过表达SPHK1可减弱鸦胆子苦醇对SKOV-3细胞上述指标的影响。体内实验显示,与对照组相比,鸦胆子苦醇低、中、高剂量组裸鼠干预21 d后的移植瘤体积均显著降低并呈剂量依赖性(P<0.05);高剂量鸦胆子苦醇还可显著降低移植瘤组织中C-myc、Bcl-2、Ncadherin、SPHK1、S1P、S1PR3蛋白表达量(P<0.05),显著升高Bax、E-cadherin蛋白表达量(P<0.05);过表达SPHK1可减弱鸦胆子苦醇对移植瘤组织上述指标的影响。结论鸦胆子苦醇可通过下调SPHK1/S1P/S1PR3信号通路蛋白表达,进而抑制卵巢癌细胞体外增殖、克隆、EMT、迁移及侵袭并诱导其凋亡,还可抑制卵巢癌细胞在裸鼠体内的生长,最终抑制其恶性生物学行为,对卵巢癌起到显著的抗癌功效。

鸦胆子苦醇调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对皮肤鳞癌细胞铁死亡的影响

目的:探讨鸦胆子苦醇调节核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)信号通路对皮肤鳞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)细胞铁死亡的影响。方法:CCK-8法检测0、100、250、500、700、900 nmol/L鸦胆子苦醇处理后人cSCC细胞系A431细胞增殖率,筛选出合适的鸦胆子苦醇作用浓度。体外培养的A431细胞随机分为对照组、鸦胆子苦醇低剂量组、鸦胆子苦醇高剂量组、特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ;Nrf2激活剂)组、鸦胆子苦醇高剂量+TBHQ组,以鸦胆子苦醇和TBHQ分组处理后,采用CCK-8法、Hoechst 33342染色法检测各组A431细胞增殖与凋亡;采用试剂盒检测各组A431细胞抗氧化因子[谷胱甘肽(glutathione,GSH)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)]水平及铁死亡指标[铁含量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)]水平;采用免疫印迹实验检测各组A431细胞增殖、凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,鸦胆子苦醇低、高剂量组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达均降低(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达均升高(P<0.05);鸦胆子苦醇高剂量组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及PCNA及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达相比鸦胆子苦醇低剂量组进一步降低(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达进一步升高(P<0.05);TBHQ组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及PCNA及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达降低(P<0.05)。与鸦胆子苦醇高剂量组相比,鸦胆子苦醇高剂量+TBHQ组细胞增殖率、GSH及CAT、SOD水平,以及PCNA及Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达升高(P<0.05),凋亡率、铁含量、ROS及MDA水平和Bax蛋白表达降低(P<0.05)。结论:鸦胆子苦醇通过下调Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路而促进铁死亡,诱导cSCC细胞凋亡,并抑制其增殖。

鸦胆子苦醇对IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损的疗效及其机制研究

目的探究鸦胆子苦醇对balb/c小鼠银屑病模型的疗效及对相关炎症因子的影响。方法将6-8周龄雌性balb/c小鼠随机分为:正常对照组、模型组、卡泊三醇组、鸦胆子苦醇高、中、低剂量组,n=6。小鼠背部剃毛,连续7天62.5mg IMQ涂抹造模,同上各组小鼠分别给予对应干预治疗。记录形态学变化并行PASI评分,干预结束后行常规HE染色,实时荧光定量PCR法检测组织NF-κB、CK1、CK10、TNF-α、IL-1β、IL-17的mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法检测NF-κB、pNF-κB、CK10、TNF-α等相关蛋白表达水平。ELISA检测血清细胞因子IL-1β、IL-17、IL-6表达水平。结果鸦胆子苦醇治疗后,小鼠银屑病样皮损明显减轻,高中低剂量组PASI评分较模型组均有明显好转(P<0.05),HE结果显示鸦胆子苦醇治疗组角质层增厚情况较模型组明显减轻,且表皮平整,表皮突恢复平整,炎症细胞浸润减轻。Real-time PCR、Western blot及ELISA结果经治疗后相关因子均明显表达下调(P<0.001)。结论鸦胆子苦醇有效减轻了银屑病小鼠皮损症状,这种改善作用可能通过NF-KB及相关炎症因子信号通路调控。

鸦胆子苦醇联合二氧化碳激光治疗尖锐湿疣的临床研究

目的:探究鸦胆子苦醇联合二氧化碳(CO_(2))激光治疗尖锐湿疣(CA)的临床效果。方法:选择CA患者80例,随机分为对照组和观察组,每组40例。对照组采用CO_(2)激光治疗,观察组在此基础上联合鸦胆子苦醇治疗。比较两组患者临床疗效、T淋巴细胞亚群[CD_(3)^(+)、CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)]水平、复发率及不良反应发生率。结果:观察组总有效率为97.50%(39/40),高于对照组的75.00%(30/40),差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组患者CD_(3)^(+)、CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)均大于治疗前(P<0.05),且观察组大于对照组(P<0.05)。观察组复发率为12.50%(5/40),低于对照组的32.50%(13/40),差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:鸦胆子苦醇联合CO_(2)激光治疗CA可获得较好的临床疗效,有效改善患者机体免疫功能,降低不良反应,减少复发率,安全性较高。

鸦胆子苦醇对非小细胞肺癌Nrf2-Notch1信号轴的影响机制研究

目的探讨鸦胆子苦醇在非小细胞肺癌A549、H460细胞增殖中的作用。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测鸦胆子苦醇对A549、H460细胞的半数抑制浓度(IC_(50));Hoechst33258染色,倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化;通过CCK-8法检测细胞活力;Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western blot免疫印迹法检测A549、H460细胞Nrf2-Notch1蛋白表达。结果鸦胆子苦醇处理A549、H460细胞的IC_(50)分别为(0.70±0.03)、(0.47±0.05)μmol/L;流式细胞试验结果显示,鸦胆子苦醇处理后A549、H460细胞凋亡率显著升高,与对照组比较差异均有高度统计学意义(均P<0.01);Western blot检测结果显示,鸦胆子苦醇可降低细胞内Nrf2-Notch1的蛋白表达。结论鸦胆子苦醇可以抑制A549、H460细胞的生长,其机制可能与抑制Nrf2-Notch1信号轴有关。

鸦胆子饮片及药渣的抗肿瘤活性比较及其鸦胆子苦醇和鸦胆子苦素A的含量测定

目的比较鸦胆子饮片及提油后药渣的抗肿瘤活性,并比较两者的苦木内酯类成分鸦胆子苦醇及鸦胆子苦素A的含量。方法采用实时电子细胞分析技术(RTCA)考察鸦胆子饮片及药渣对A549细胞的抑制效应,并采用高效液相色谱法同时测定两者的鸦胆子苦醇及鸦胆子苦素A的含量。结果鸦胆子饮片及药渣对A549细胞都具有一定的抑制效应,饮片和药渣的IC50值分别为4.576~7.256 mg/mL和4.115~9.766 mg/mL,鸦胆子饮片和鸦胆子药渣中鸦胆子苦醇及鸦胆子苦素A的总含量分别为0.113 9%~0.143 5%和0.110 0%~0.135 9%。结论鸦胆子饮片及药渣都具有一定的抗肿瘤活性,药渣中的抗肿瘤活性成分鸦胆子苦醇及鸦胆子苦素A的含量与饮片比较,没有显著差异,鸦胆子提油后的药渣可针对苦木内酯类成分进行深入研究开发和资源综合利用。

鸦胆子苦醇抑制人前列腺癌DU145细胞生长及作用机制

中药鸦胆子是一种常用的抗肿瘤中草药,鸦胆子苦醇是来源于鸦胆子的主要成分。该研究探讨了鸦胆子苦醇(brusatol)对人前列腺癌DU145细胞的生长抑制及其作用机制。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测鸦胆子苦醇对不同细胞株的生长抑制情况,以及不同浓度的鸦胆子苦醇对DU145细胞的增殖抑制率;应用Hoechst 33258染色法观察鸦胆子苦醇处理DU145细胞后所发生的形态学变化;分别采用PI单染及AnnexinV-FITC双染法流式细胞术分析细胞周期分布个凋亡率的变化;以Western blot测定鸦胆子苦醇对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。结果表明:鸦胆子苦醇对人前列腺癌DU145细胞的抑制作用更为显著,并且可以时间和剂量依赖性地抑制人前列腺癌DU145细胞的生长,其半数有效抑制浓度IC50为(0.27±0.04)μmol·L-1;鸦胆子处理DU145细胞后,Hoechst 33258染色可见到明显的凋亡特征;细胞周期图中可见明显的亚二倍体峰,且随着作用时间的延长凋亡比例增加,FCM检测鸦胆子苦醇作用24 h后凋亡图中,可见凋亡的发生;Western blot检测表明鸦胆子苦醇处理后可使磷酸化的p38和JNK表达增加,使磷酸化的ERK表达降低。鸦胆子苦醇能显著抑制DU145细胞增殖,诱导DU145细胞凋亡。磷酸化的P38和JNK的表达增加,但磷酸化的ERK表达下降,这表明MAPK途径的活化可能是鸦胆子苦醇对DU145细胞生长抑制的作用机制之一。因此,鸦胆子苦醇是潜在的抗前列腺癌药物,有必要进一步在动物水平阐明其抗前列腺癌活性。

鸦胆子苦醇抑制人非小细胞肺癌A549细胞转移的机制

目的探讨鸦胆子苦醇对人非小细胞肺癌A549细胞转移能力的抑制作用及其机制。方法采用Reed-Muench法计算鸦胆子苦醇对A549细胞的半数致死浓度(LC50);通过CCK-8测定细胞活力绘制增殖曲线和流式细胞周期测定鸦胆子苦醇对A549细胞增殖能力的影响;采用Transwell法检测鸦胆子苦醇对A549细胞株转移的抑制情况,以及在半数致死浓度的鸦胆子苦醇浓度下不同时间对细胞转移的抑制率;应用Western印迹法检测细胞转移相关蛋白的表达情况。结果非小细胞肺癌A549细胞的增殖能力在鸦胆子苦醇处理后基本没有变化;鸦胆子苦醇处理后A549细胞的转移能力与对照组相比明显下降,且在一定作用时间范围内有时间依赖性;肿瘤转移相关蛋白(BRF)2、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、CD151的表达水平在鸦胆子苦醇处理后的细胞中明显下调。结论鸦胆子苦醇是潜在的抗非小细胞肺癌的药物,有必要进一步阐明其抗非小细胞肺癌的分子机制,为临床治疗提供一定的指导意义。

鸦胆子苦醇对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:研究鸦胆子苦醇(BRU)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡影响。方法:用BRU处理MDA-MB-231细胞。采用CCK-8法检测MDA-MB-231细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率和周期。结果:BRU对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生长抑制率测定结果显示,不同浓度的BRU对MDA-MB-231细胞生长抑制率与对照组相比存在明显差异,均具有统计学意义(均P<0.05),且呈时间与浓度依赖性,凋亡结果显示,经5、10、20、40μmol/L BRU作用细胞48 h后,随着浓度增高细胞的凋亡率也相应提高,与空白对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)。周期结果提示经5、10、20、40μmol/L BRU作用细胞48 h后,随药物浓度增加,处于G 0/G 1期的细胞比例逐渐增加,S/G 2/M期的细胞比例下降,与空白对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:中药鸦胆子苦醇在体外能抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长,并能诱导该细胞凋亡。

鸦胆子不同药材及部位中鸦胆子苦醇含量分析

目的:建立中药鸦胆子苦醇的高效液相色谱检测方法,测定鸦胆子不同药材及同一药材不同部位中鸦胆子苦醇的含量。方法:采用Sepax Sapphire C_(18)色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),乙腈-水溶液(体积比为40∶60)为流动相,流速为1.0mL·min^(-1),检测波长235nm,柱温30℃。结果:鸦胆子苦醇在质量浓度为61.6~1 060μg·mL^(-1)呈良好的线性关系,(r=0.9994,n=5),平均回收率为100.87%,RSD为2.01%(n=5)。同一药材不同部位,仁中鸦胆子苦醇最高,壳中最少;对不同药材,大药材中的鸦胆子苦醇是小药材中的2.6倍。结论:本研究建立的方法重复性好,准确可靠;结果表明鸦胆子同一药材不同部位及不同质量的药材中,鸦胆子苦醇含量差异比较大。

鸦胆子苦醇通过RhoA/ROCK1信号通路抑制人结直肠癌细胞HCT-116的侵袭和迁移

目的探讨鸦胆子苦醇(brusatol,BRU)对结直肠癌细胞HCT-116侵袭和迁移的影响和可能的作用机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度的BRU对HCT-116细胞增殖能力的影响;划痕和Transwell实验检测BRU对HCT-116细胞迁移能力和侵袭能力的影响;Western blot检测BRU和ROCK抑制剂(Y27632)对HCT-116细胞中迁移侵袭相关蛋白MMP2、MMP9和RhoA、ROCK1表达的影响。结果CCK-8结果显示,经过BRU(0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol·L^(-1))处理HCT-116细胞24、48、72 h后,BRU对HCT-116细胞的抑制率明显升高,并且呈浓度和时间依赖性;划痕和Transwell实验结果显示,BRU能明显抑制HCT-116细胞的迁移和侵袭能力;Western blot结果表明,BRU和Y27632都能够明显减少HCT-116细胞中的MMP2、MMP9、RhoA和ROCK1蛋白的表达。结论BRU可能通过RhoA/ROCK1通路抑制结直肠癌细胞HCT-116的迁移和侵袭。

鸦胆子苦醇通过调节细胞骨架力学性质抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的侵袭行为

目的研究鸦胆子苦醇对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)细胞骨架力学性质的调控以及对RA FLS侵袭行为的影响。方法细胞骨架染色法检测鸦胆子苦醇对RA FLS细胞骨架力学性质的调控;Transwell小室法检测鸦胆子苦醇对RA FLS细胞骨架的调控和对RA FLS侵袭行为的影响;酶谱和Western blotting法检测鸦胆子苦醇对RA FLS中MMP-2、MMP-3表达的影响。结果通过细胞骨架染色并在显微镜下观察发现,鸦胆子苦醇可显著减少RA FLS伪足数量的产生,通过调节细胞骨架网络的力学性质抑制细胞的运动能力,鸦胆子苦醇可抑制RA FLS的侵袭并能下调MMP-2、MMP-3的表达水平。结论鸦胆子苦醇能调节RA FLS的细胞骨架的力学性质并抑制细胞的侵袭行为,同时鸦胆子苦醇可通过降低MMP-2、MMP-3的表达抑制RA FLS的侵袭。研究结果为进一步开发治疗RA的新药物提供了相应实验依据。

鸦胆子苦醇阻滞小鼠早期胚胎发育的作用机制

目的截止目前,鸦胆子苦醇在小鼠早期胚胎发育中的作用及其作用机制仍不清楚。文中旨在探究鸦胆子苦醇对小鼠早期胚胎发育的影响及其可能的作用通路。方法取100只健康清洁级昆明小鼠(雌鼠80只,雄鼠20只)分为6组:阴性对照组(不添加DMSO)、空白对照组(新鲜CM中培养添加等量DMSO)以及20 nmol/L鸦胆子苦醇组、50 nmol/L鸦胆子苦醇组、100 nmol/L鸦胆子苦醇组、200 nmol/L鸦胆子苦醇组(用CM分别稀释鸦胆子苦醇浓度为20、50、100、200 nmol/L)。每组每次平均使用20枚胚胎,重复4次。受精卵培养24、48、72、96 h分别为2-细胞期、4-细胞期、桑葚胚期和囊胚期。观察各组各期发育率并筛选出最适浓度,并通过免疫荧光染色检测核因子E2相关因子2(Nrf2)的定位,实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别比较G2/M期Cyclin B,CDK1 mRNA水平以及Nrf2蛋白表达的变化。结果在4-细胞期,20、50、100 nmol/L鸦胆子苦醇组胚胎发育率[(75.0±2.8)%、(30.4±7.5)%、(4.2±5.9)%]较阴性对照组[(93.0±2.8)%]、空白对照组[(90.9±1.2)%]显著降低(P<0.05)。在桑葚胚期,与阴性对照组、空白对照组桑葚胚形成率[(83.5±2.1)%、(84.2±1.2)%]比较,50nmol/L鸦胆子苦醇组[(19.3±13.1)%]显著降低[(79.00±0.06)%vs 100%,P<0.05]。50 nmol/L鸦胆子苦醇组Nrf2蛋白的表达较空白对照组显著降低(P<0.05)。50 nmol/L鸦胆子苦醇组G2/M期Cyclin B[(59.5±9.2)%]、CDK1 mRNA[(56.0±1.4)%]的表达较空白对照组(100%)显著降低(P<0.05)。结论鸦胆子苦醇可能通过下调Nrf2,调节Cyclin B-CDK1复合物的表达影响细胞周期由G2向M期转变,进而抑制胚胎发育。

鸦胆子苦醇抑制H1299非小细胞肺癌细胞增殖和促进其凋亡的机制

目的研究鸦胆子苦醇(brusatol,BRU)对H1299非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法使用CCK-8法与EdU实验检测BRU对细胞增殖的影响;克隆形成实验检测BRU对细胞克隆形成的影响;Hoechst33258染色实验与流式细胞仪观察细胞凋亡情况;Western blot检测Bax、Bcl-2、Bcl-xL、cleaved-caspase-3、caspase-3、Gadd45α、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、细胞核与胞质中NF-κB-p65的蛋白质水平。结果CCK-8实验发现,随着BRU浓度与作用时间的增加,H1299细胞受到的抑制作用逐渐增强;EdU实验显示,BRU处理组的EdU掺入率明显下降;克隆形成实验结果显示,BRU能抑制H1299细胞的克隆形成能力;Hoechst33258实验与流式细胞仪检测发现,BRU能使H1299细胞胞核呈现凋亡状态并增加其凋亡率;Western blot显示BRU可上调Bax、cleaved-caspase-3、Gadd45α,下调Bcl-xL、Bcl-2、caspase-3、p-PI3K、p-Akt与胞核中p65的蛋白质水平。结论BRU以浓度和时间依赖抑制H1299细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路的激活并抑制NF-κB-p65的核转运有关。

鸦胆子苦醇对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察鸦胆子苦醇(BRU)对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响,探讨其作用机制。方法用BRU处理MCF-7细胞。采用CCK-8法和流式细胞术检测MCF-7细胞抑制率和凋亡率,Western blot检测线粒体凋亡通路和内质网应激(ERS)相关蛋白的表达,利用免疫荧光技术实现Nrf2和p53蛋白定位。结果与对照组比较,BRU显著抑制MCF-7细胞增殖,110 nmol/L BRU诱导MCF-7细胞凋亡有时间依赖性。110 nmol/L BRU显著降低Nrf2及下游蛋白表达,显著增加GRP78、p-PERK/PERK、p-e IF2α/e IF2α、ATF4、CHOP、Apaf-1、Bax/Bcl-2、CytochromeC、Cleaved-caspase3、p53和p21蛋白的表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001),细胞核Nrf2蛋白含量减少、p53蛋白含量增加。结论 BRU通过诱发ERS,抑制Nrf2蛋白表达和核转移,破坏抗氧化作用,诱导MCF-7细胞凋亡。

鸦胆子苦醇对人非小细胞肺癌H1299细胞辐射增敏作用研究

目的:探讨鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)对人非小细胞肺癌H1299细胞辐射增敏作用及其机制。方法:利用CCK-8法检测BRU对H1299细胞的抑制率和半数抑制浓度(IC50),将H1299细胞分为对照组、BRU组(IC50)、X射线组(2 Gy)和BRU联合X射线组(BRU+2 Gy)。应用克隆形成实验检测细胞存活率,流式细胞仪检测照射后24 h细胞凋亡率和胞内活性氧含量(reactive oxygen species,ROS);Western blotting技术检测PI3K/Akt/Nrf2信号通路和线粒体凋亡通路相关蛋白表达;免疫荧光技术实现Nrf2蛋白定位。结果:BRU的IC50为100 nmol/L,用该浓度处理H1299细胞24 h后,Nrf2表达量最低;100 nmol/L BRU联合2 Gy的X射线照射后,与对照组比较,BRU组、2 Gy组和BRU+2 Gy组细胞存活率降低、细胞凋亡率和ROS升高;与2 Gy组比较,BRU+2 Gy组细胞存活率降低、细胞凋亡率和ROS升高;与对照组比较,BRU组、2 Gy组和BRU+2 Gy组PI3K和Akt磷酸化水平降低、Nrf2蛋白表达量降低,细胞核中Nrf2蛋白含量减少,线粒体凋亡通路相关蛋白表达量升高;与2 Gy组比较,BRU+2 Gy组PI3K和Akt磷酸化水平降低、线粒体凋亡通路相关蛋白表达量升高。结论:BRU联合X射线通过抑制PI3K/Akt/Nrf2信号通路,增加H1299细胞凋亡,从而增强H1299细胞的辐射敏感性。

鸦胆子苦醇抑制黑色素瘤生长和增殖的作用机理研究

目的研究中药鸦胆子苦醇对黑色素瘤细胞增殖和凋亡的作用机制。方法采用细胞活力测定(MTS)不同浓度的鸦胆子苦醇对黑色素瘤A375细胞生长抑制率;应用PI单染及Annexin-V-FITC双染法流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡率的变化;以DCFA-DA荧光探针标记细胞,分析活性氧簇(ROS)的产生;利用Western Blot检测Nrf2及Akt通路蛋白表达的影响。结果鸦胆子苦醇对黑色素瘤细胞的生长抑制呈剂量依赖性;鸦胆子苦醇处理A375细胞后,细胞周期阻滞在G1期,S期减少。且鸦胆子苦醇诱导细胞细胞凋亡发生;免疫沉淀检测结果表明鸦胆子苦醇处理移植Nrf2蛋白的表达,使磷酸化Akt表达减少。结论鸦胆子苦醇可抑制细胞增殖,并诱导ROS的生成及细胞凋亡发生。Akt途径的抑制可能是鸦胆子苦醇对A375细胞生长抑制及凋亡诱导的作用机制之一。因此,鸦胆子苦醇可能是潜在的抗黑色素瘤的药物。

鸦胆子苦醇诱导NOX4过表达的H1299细胞凋亡的研究

目的探讨鸦胆子苦醇(Brusatol)对NOX4过表达的H1299细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法将H1299分为空白对照及NOX4过表达组,用Western blotting及q RT-PCR检测NOX4及Nrf2的表达;过氧化氢检测试剂盒检测细胞中活性氧簇(ROS)水平;流式细胞术及Caspase-Glo 3/7检测细胞的凋亡情况。结果与空白对照组相比,经质粒p CMV-NOX4转染后H1299细胞NOX4蛋白表达显著升高;NOX4过表达的H1299细胞Nrf2蛋白表达显著升高,m RNA水平无影响;鸦胆子苦醇能够抑制H1299细胞中Nrf2蛋白的表达;鸦胆子苦醇能够使得NOX4的促增殖作用被逆转。结论 H1299细胞中,NOX4能够增加Nrf2稳定性,使得细胞产生氧化还原适应;鸦胆子苦醇能够破坏氧化还原适应机制,诱导NOX4过表达的H1299细胞凋亡。

不同浓度鸦胆子苦醇对小鼠矽肺纤维化的影响

[背景]矽肺是一种肺部弥漫性纤维化疾病,由长期暴露于游离二氧化硅(SiO_(2))粉尘引起,发病机制复杂,缺乏有效的治疗。鸦胆子苦醇(Bru)具有多种生物活性,其在矽肺纤维化中的作用尚不明确。[目的]探究不同浓度Bru对SiO_(2)诱导小鼠矽肺纤维化的影响。[方法]将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、矽尘组、Bru低剂量(1 mg·kg^(-1))组、Bru中剂量(2 mg·kg^(-1))组、Bru高剂量(4 mg·kg^(-1))组,每组6只;除对照组外,其余各组均采用一次性非气管暴露法滴注50μL、60 mg·mL^(-1)SiO_(2)悬浊液建立矽肺小鼠模型,对照组滴注等量生理盐水;Bru组于染尘的同时腹腔注射Bru,连续注射5d,随后隔天注射,染尘28 d后处死小鼠,收集肺组织。测定小鼠肺系数;采用苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色观察小鼠肺组织的病理变化;Western blot法检测小鼠肺组织中凋亡蛋白Cleaved-caspase 3、纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-I)、自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Sequestosome 1(p62/SQSTM1)蛋白、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1),核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达水平;实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测小鼠肺组织中Caspase 3、α-SMA和Col-lmRNA水平。[结果]与对照组相比,矽尘组小鼠的肺系数明显升高(P<0.01);肺组织中肺泡壁受损,出现炎性细胞浸润、纤维结节和胶原纤维沉积;Cleaved-caspase 3、α-SMA和Col-I的蛋白表达及转录水平均明显上调(P<0.01);Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、Nrf2表达水平增加(P<0.05,P<0.01),而Keap1表达水平下降(P<0.05)。与矽尘组相比,Bru低、中剂量组小鼠肺系数降低(P<0.05);肺组织的病理损伤及胶原沉积明显改善;Cleaved-caspase 3、α-SMA和Col-I的蛋白表达及转录水平下降(P<0.05,P<0.01),Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、Nrf2表达水平也均明显下降(P<0.05,P<0.01),中剂量组Keap1水平上升(P<0.05)。与矽尘组相比,Bru高剂量组肺系数、病理损伤、Cleaved-caspase 3、α-SMA和Col-I的蛋白表达及转录水平差异无统计学意义(P>0.05);Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ及Nrf2表达水平降低(P<0.01),p62蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),Keap1蛋白水平上升(P<0.01)。[结论]低、中剂量Bru可能通过Keap1-Nrf2通路调控自噬,改善自噬降解障碍,降低矽肺小鼠的肺系数,减轻矽肺小鼠肺组织中的细胞凋亡,延缓矽肺纤维化的进展。

鸦胆子苦醇调节cGAS-STING信号通路对肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响

目的 探讨鸦胆子苦醇调节环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cGAS)-干扰素基因刺激因子(STING)信号通路对肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响。方法 通过左前肢腋窝sc接种H22细胞建立荷瘤小鼠模型,随机分为模型组,鸦胆子苦醇低、中、高剂量(0.916、1.832、3.664 mg·kg^(-1),ig给药)组,鸦胆子苦醇(3.664 mg·kg^(-1),ig给药)+RU.521(5 mg·kg^(-1),ip给药)组。干预结束后,取胸腺、脾脏、肿瘤称质量,测定小鼠胸腺和脾脏指数、抑瘤率;T淋巴细胞转化实验检测T淋巴细胞增殖指数;检测巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力;收集血清,试剂盒法检测白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;Western blotting法检测肿瘤组织中cGAS、STING蛋白表达水平。结果 与对照组相比,模型组小鼠胸腺和脾脏指数、吞噬指数、吞噬百分率、T淋巴细胞增殖指数、IL-2和TNF-α水平显著下降(P<0.05);与模型组相比,鸦胆子苦醇低、中、高剂量组小鼠胸腺和脾脏指数、吞噬指数、吞噬百分率、T淋巴细胞增殖指数、IL-2和TNF-α水平、cGAS和STING蛋白表达显著增加(P<0.05),瘤质量显著降低(P<0.05),且作用均呈现剂量相关性;与鸦胆子苦醇高剂量组相比,鸦胆子苦醇+RU.521组胸腺和脾脏指数、吞噬指数、吞噬百分率、T淋巴细胞增殖指数、IL-2和TNF-α水平、cGAS和STING蛋白表达显著下降(P<0.05),瘤质量显著增加(P<0.05)。结论 鸦胆子苦醇通过激活cGAS-STING信号通路抑制肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤生长,增强其免疫功能。