氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒(DHBV)作用的研究

通过建立鸭原代肝细胞-DHBV感染模型研究氧化苦参碱抗DHBV的作用。分别在DHBV感染前、感染同时以及感染后给药，利用打点杂交、Southern印迹核酸杂交和荧光定量PCR方法分别检测培养细胞上清及细胞内病毒核酸，观察氧化苦参碱在病毒感染的各个环节所起的抗病毒作用。实验结果显示：1mg／mL氧化苦参碱处理细胞后，鸭原代肝细胞培养上清及细胞内的DHBV核酸明显低于病毒感染对照组，病毒抑制率达91．6％；在病毒感染同时加药对病毒的抑制率可达98．5％；感染后持续用药能使不同培养天数的鸭肝细胞内的DHBV核酸降低60．5％～96．6％；氧化苦参碱与DHBV共孵育后，可以使病毒感染力下降69．6％。结果说明氧化苦参碱可以在DHBV感染鸭原代肝细胞的多个环节，包括病毒吸附、进入细胞及细胞内复制等方面发挥抗病毒作用。

蛋氨酸对HepG2细胞和鸭原代肝细胞生长和脂质代谢的影响

本研究旨在研究蛋氨酸(Met)对HepG2细胞和鸭原代肝细胞生长及脂质代谢的影响。设置2个体外肝细胞试验,分别以HepG2细胞和鸭原代肝细胞为研究对象,研究不同浓度Met培养基对HepG2细胞和鸭原代肝细胞的存活率、脂质沉积及其相关基因和蛋白表达的影响。结果表明:1)培养基中Met浓度为0μmol/L时HepG2细胞存活率显著低于其他Met浓度(P<0.05),培养基中Met浓度为0、6.25、12.5和25μmol/L时鸭原代肝细胞存活率显著低于显著100和200μmol/L时(P<0.05),随着培养基Met浓度增加,25μmol/L Met时HepG2细胞存活率达到平台,100μmol/L Met时鸭原代肝细胞存活率达到平台。2)与200μmol/L Met组相比,0、25μmol/L Met组脂滴数量明显增加,单位细胞数目油红O的吸光度显著增加(P<0.05),且0、25μmol/L组之间无显著差异(P>0.05)。3)与200μmol/L Met组相比,0、25μmol/L Met组HepG2细胞中链酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)、二氢硫辛酸脱氢酶(DLD)和泛醌还原型酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶Fe-S蛋白1(NDUFS1)基因表达量显著下调(P<0.05),且0μmol/L Met组NDUFS1蛋白表达量显著下调(P<0.05)。4)与200μmol/L Met组相比,0、25、100μmol/L Met组鸭原代肝细胞中苹果酸脱氢酶(MDH)1、MDH2、DLD、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶2(HMGCS2)、电子转移黄素蛋白α亚基(ETFA)、电子传递黄素蛋白脱氢酶(ETFED)和NDUFS1基因表达量显著下调(P<0.05),且0、25μmol/L Met组NDUFS1蛋白表达量显著下调(P<0.05)。综上所述,Met缺乏可导致HepG2细胞和鸭原代肝细胞生长受阻和脂质沉积增加,主要由于肝细胞中脂肪酸β-氧化、三羧酸循环、呼吸链电子传递和酮体生成等过程受阻,导致肝细胞能量供应不足。

珠子草等对原代鸭肝细胞的延长生长作用

我们在原代鸭肝细胞培养中，观察到珠子草及其亚种等提取物可以延长肝细胞生长，从而抑制纤维母细胞增生。

鸭乙型肝炎病毒在鸭肝原代细胞中复制的试验观察

取正常雏鸭肝脏制备原代细胞，在细胞培养板中进行鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）感染，通过ＰＣＲ、紫外分光光度仪、细胞原位杂交等实验技术的检测，观察ＤＨＢＶ在鸭肝原代细胞中的复制。结果，ＤＨＢＶ感染鸭肝原代细胞后３ｄ，病毒即表现出明显的复制现象，在随后一周内细胞内ＤＨＢＶ复制逐渐增强；第二周病毒复制能力开始逐渐衰减，３５ｄ后复制能力基本消失。病毒分布和复制区域主要在肝细胞核内。

鸭ChREBP基因表达载体构建及其对原代肝细胞和PC3细胞脂质性状的影响

【目的】探究鸭原代肝细胞脂质含量与碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达的关联性,为深入研究ChREBP基因对畜禽脂质代谢的遗传调控机制提供参考依据。【方法】采用Ⅳ型胶原酶消化法分离孵化21 d的鸭胚原代肝细胞,以DMEM高糖培养基进行培养。利用RT-PCR扩增鸭ChREBP基因编码区(CDS)序列,构建携带His标签的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His,通过脂质体法分别转染鸭胚原代肝细胞和人前列腺癌细胞(PC3);采用His标签检测试剂盒检测ChREBP基因的表达量,以脂质指标测定试剂盒测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量,并分析鸭胚原代肝细胞和PC3细胞中ChREBP基因表达与脂质指标含量的相关性。【结果】以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞均能发出绿色荧光,表明携带His标签的ChREBP基因能在鸭原代肝细胞和PC3细胞中表达。ChREBP基因表达量与鸭原代肝细胞和PC3细胞中的TG、TC和HDL含量均呈极显著正相关(P<0.01,下同),与LDL含量呈极显著负相关。【结论】以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞后均能发出绿色荧光,说明ChREBP基因表达对鸭原代肝细胞和PC3细胞中的脂质代谢作用机理相似,可促进细胞脂质累积。

鸭γ干扰素体外抑制鸭乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 在体外模型中系统研究DuIFN γ对鸭乙型肝炎病毒 (DHBV)复制的影响 ,探讨其抑制病毒复制的可能机制。方法 用重组DuIFN γ及DHBV特异抗原刺激的PBMC上清液 ,分别作用于DHBV慢性感染的原代鸭肝细胞 (PDH) ,检测PDH上清液中DHBVDNA、DHBsAg浓度和胞内病毒复制水平。结果 1U mL、1 0U mL重组DuIFN γ可以抑制培养细胞上清液中DHBVDNA和DHBsAg的分泌 ,与慢性感染对照组比较 ,P <0 .0 5。病毒复制的抑制水平 (包括细胞内DHBV总DNA、闭合环状DNA以及上清液中病毒颗粒和DHBsAg)与DuIFN γ作用呈时间、剂量依赖性 ,但DHBV特异抗原刺激的PBMC上清液无明显抑制病毒复制的作用。结论 DuIFN

HBV DNA转染原代鸭肝细胞初步观察

目的 通过观测人ＨＢＶ ＤＮＡ在非哺乳动物──鸭肝细胞中的复制和表达水平，探讨人ＨＢＶ感染与复制的跨种属特异性，为建立人ＨＢＶ ＤＮＡ转染跨种属肝细胞模型奠定基础。方法 获取线性ＨＢＶ ＤＮＡ并电转染原代鸭肝细胞，电转后４８ｈ采用ＩＭＸ系统检测鸭肝细胞中ＨＢｓＡｇ和 ＨＢｅＡｇ表达水平，用 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ－ｔｉｎｇ和ｄｏｔ ｂ１ｏｔｔｉｎｇ检测ＨＢＶ ＤＮＡ复制情况。以单纯电击肝细胞为对照。结果 转染组原代鸭肝细胞裂解液中ＨＢｓＡｇ为９．１０（Ｐ／Ｎ值≥ ２．１为阳性），ＨＢｅＡｇ为阴性；上清液中二者均为阴性。转染组原代鸭肝细胞裂解液ｄｏｔｂｌｏｔｔｉｎｇ呈强阳性；转染组肝细胞总 ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ显示约４．０ ｋｂ以下分子涂抹带，为游离复制型 ＨＢＶＤＮＡ，包括 ｒｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ与 ｓｓＤＮＡ等复制中间体；未见整合型 ＨＢＶ ＤＮＡ──高分子区（４．０－２４．０ ｋｂ）涂抹带。对照组上述指标均为阴性。结论 人ＨＢＶ ＤＮＡ能在原代鸭肝细胞中复制和表达，可能为肝细胞内环境依赖性，无严格种属特异性限制。

基因C型鸭甲型肝炎病毒在鸭胚原代肝细胞中的增殖规律

为建立基因C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-C)在鸭胚原代肝细胞(DELC)上的感染模型,利用17日龄鸭胚制备了DELC,接种DHAV-C,观察接毒后DELC的病变情况,并采用荧光定量PCR方法对病毒含量进行测定,绘制病毒增殖曲线。结果显示,DELC在接毒后第36小时开始出现细胞病变,第60小时细胞病变最为明显,表现为细胞间隙增大、拉网成丝状、细胞脱落。DHAV-C感染DELC后第12、24、36、48、60、72、84、96小时的病毒量分别为1.23×108、2.14×108、2.95×108、4.37×108、5.75×108、1.70×108、9.55×107和6.46×107 copies/μL。结果表明,本研究成功建立了DHAV-C在DELC上的感染模型,为进一步研究DHAV-C的致病机理、病毒与细胞的相互作用以及建立免疫学诊断方法奠定了基础。

苯丙氨酸二肽类化合物Y101对DHBV-DNA的影响

目的探讨苯丙氨酸二肽类化合物Y101对感染鸭乙肝病毒的北京雏鸭体内外DHBV-DNA表达的影响。方法90只感染DHBV的北京雏鸭随机分为对照组、Y101剂量组和拉米夫定组,各组雏鸭于给药前(d 0)、给药5 d(d 5)、10d(d 10)及停药后3 d(P 3)经腿胫静脉取血,分离血清,斑点杂交法测定鸭血清中DHBV-DNA的含量;利用灌流法分取感染鸭乙肝病毒的北京雏鸭的原代肝细胞,采用QuickEx-tract DNA Extraction Soln 1.0提取鸭原代肝细胞Y101剂量组、拉米夫定对照组和正常对照组细胞内和细胞上清中的DHBV-DNA,用TaqMan探针实时荧光定量法检测DHBV-DNA含量,观察Y101对其抑制作用。结果 Y101对体内外DHBV-DNA都具有良好的抑制作用,体内0.05、0.025 g.kg-1剂量组抑制作用明显,体外80、60 mg.L-1剂量组抑制作用最强,DNA含量明显下降(P<0.05)。结论Y101可以有效的抑制DHBV-DNA的表达,抗病毒作用明显。

拉米夫定联合原儿茶酸对鸭乙肝病毒的体外抑制

目的:研究原儿茶酸(PA)、拉米夫定(3TC)单用以及联合对鸭HBV(DHBV)感染、复制不同时期的影响。方法:利用感染DHBV的鸭原代肝细胞模型,从病毒感染的不同时期研究PA、3TC单用及合用的抗病毒效果。结果:PA、3TC单用及其合用,分别于DHBV感染前,感染的同时及感染后给药,均可有效抑制DHBV对鸭原代肝细胞的感染。虽然PA与3TC合用对DHBV的预防与阻断作用与单用3TC相比没有显著差异,但对DHBV的吸附与进入,感染活性与复制能力,以及肝细胞中AST,ALT酶活的抑制能力均显著强于单用3TC组。结论:PA与3TC药物组合不仅有比二者单用更强的抗DHBV作用,而且对DHBV所致鸭原代肝细胞损伤也有更强的保护作用。