2019—2022年广西鸭圆环病毒分子流行病学研究

【目的】了解广西鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)的遗传进化特征。【方法】试验于2019—2022年从广西地区采集761份病死鸭临床样本,利用实时荧光定量PCR检测DuCV感染情况。通过PCR扩增DuCV全基因组序列,利用DNAStar分析其与参考毒株核苷酸和氨基酸序列相似性,使用RDP4和SimPlot 3.5.1软件分析DuCV重组事件,采用Mega 7.0软件构建遗传进化树,应用BioEdit软件分析DuCV Cap蛋白氨基酸变异位点。【结果】DuCV阳性率为22.5%,基因组大小为1988~1996 bp。广西DuCV毒株全基因组、Rep和Cap基因与参考毒株核苷酸序列相似性分别为71.9%~99.6%、83.1%~99.9%和52.8%~99.9%。基因重组分析显示,DuCV-GX13-2019和DuCV-GX14-2020存在重组事件。Cap蛋白共有78个氨基酸位点发生突变,与DuCV-1相比,DuCV-2在第3、12、15、23、31、42、56和64位氨基酸处完全变异。广西毒株为DuCV-1和DuCV-2基因型,DuCV-1为主要优势毒株,且DuCV-1b亚型流行最为广泛。【结论】广西地区DuCV发病较严重,部分毒株存在重组事件,Cap蛋白突变率高,DuCV多种亚型均有流行。研究结果为广西地区DuCV流行病学调查提供基本数据。

2020年江苏地区鸭圆环病毒分子流行病学调查及分离方法的初步研究

为了解2020年江苏地区鸭圆环病毒(DuCV)的流行情况、分子特性及探索其分离方法,通过采集江苏部分地区疑似患鸭圆环病的病、死鸭脏器组织,研磨后提取DNA,运用PCR技术扩增该病毒全基因组并测序,分析其分子流行病学特征,确定遗传谱系。将PCR检测阳性的组织病料上清经绒毛尿囊膜接种9日龄SPF鸭胚,分别收集鸭胚绒毛尿囊膜和尿囊液,以相同的方法将PCR检测阳性的尿囊膜/尿囊液进行鸭胚传代,尝试探索分离DuCV的方法。采集的23份样品中共检测出阳性样本10份。病毒基因组序列分析结果表明10株分离株均属于DuCV 1型的分支,传代结果表明多数样本在第1代绒毛尿囊膜和尿囊液样品中可检出DuCV,仅有部分样本在第2、3代的绒毛尿囊膜PCR检测结果呈阳性,传至第4代次时就检测不到病毒核酸。检测的结果一定程度上也表明绒毛尿囊膜检出率高于尿囊液。该结果为江苏地区该病的防控提供了一定的参考价值。

杆状病毒表达系统中NLS序列对鸭圆环病毒Cap基因表达的影响及其免疫原性研究

为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus,DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBacⅠ中,通过杆状病毒表达系统进行表达,分析NLS序列对Cap蛋白表达的影响。采用不同的免疫策略,分别以原核表达系统构建的重组蛋白rCap(rCap组)、杆状病毒表达系统构建的rvAc-Cap(rvAc-Cap组)及rCap与rvAc-Cap联合(Prime-Boost组)作为免疫源免疫Balb/c小鼠,并设置PBS对照组,定期采血,检测DuCV IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数(SI)和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子水平,评价其免疫效果。结果表明:利用杆状病毒表达系统成功表达出重组杆状病毒rvAc-Cap和rvAc-NLS-Cap,且去除NLS序列的Cap基因表达水平更高;小鼠免疫重组蛋白rCap后,重组蛋白rCap与重组杆状病毒rvAc-Cap均能够刺激小鼠产生特异性IgG抗体,三免后Prime-Boost组的IgG抗体水平最高,而与其他免疫组差异不显著(P>0.05);三免后各免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组,差异显著(P<0.05);各免疫组IFN-γ、IL-2和IL-4水平与PBS对照组比较差异显著(P<0.05),且Prime-Boost组水平最高。说明在杆状病毒表达系统中去除NLS序列可以提高Cap基因的表达;重组杆状病毒rvAc-Cap能够活化小鼠的免疫系统,刺激小鼠机体产生体液免疫与细胞免疫,而Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。

一例鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒混合感染樱桃谷肉鸭的病例报告

2023年8月,广西某养鸭场鸭子突发软脚、腿部肌肉震颤等神经症状,为探究该场鸭群致病病原,对该鸭场的患病鸭进行调查。剖检结果显示:患病鸭肝脏轻度肿大、质脆,呈黄褐色,肾脏肿大。病理切片显示:肝细胞胞质中可见微小圆形空泡,可见少量淤血;脾脏组织见较多细胞坏死,细胞核固缩。病原检测结果显示:鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭圆环病毒(DuCV)为阳性,细菌及其他病原检测结果为阴性。序列分析发现,该场流行的DTMUV与SCS01毒株遗传距离最近,属于Cluster 2.1;DuCV与山东毒株YF180401遗传距离最近,属于DuCV-1型,确定该养殖场鸭群突然发病为DTMUV混合感染DuCV所致。这两种病毒都是临床中常见危害鸭群的病原,但混合感染情况却少有报道。该研究旨在为我国今后开展DTMUV和DuCV的检测和综合防控提供参考。

鸭圆环病毒两种基因型PCR鉴定方法的建立及应用

为了建立区分鸭圆环病毒两种基因型的双重PCR方法,试验针对Ducv-1、Ducv-2两种基因型参考序列的Cap基因,设计特异性引物,并对该双重引物进行特异性、敏感性、重复性等试验。结果显示,试验可以特异性地扩增出鸭圆环病毒1型(700 bp)和鸭圆环病毒2型(1 080 bp)毒株的目的条带。该方法仅对鸭圆环病毒1型和2型检测为阳性,对鸭圆环病毒两种基因型的检测限分别为4.20×10^(3) copies/uL和4.00×10^(3) copies/uL。使用该双重引物进行重复性检测,结果一致,重复性较好。使用建立的该鸭圆环病毒不同基因型鉴定方法对实验室收集的疑似鸭圆环病毒阳性样品进行鉴别诊断,结果显示5份样品在700 bp处出现明亮条带,属于圆环病毒1型,另外1份为阴性。本研究建立的双重PCR方法可用于市场上鸭圆环病毒两种基因型的鉴别诊断,为鸭圆环病毒病的诊断提供参考。

鹅细小病毒、番鸭细小病毒及鸭圆环病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法,本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与DuCV Rep基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及DuCV的TaqMan荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、DuCV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒,结果显示,该方法仅能扩增出GPV、MDPV及DuCV,与其他主要水禽源病毒均无交叉反应,特异性强;利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及DuCV质粒标准品混合物,结果显示,该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×10^(1)拷贝/μL,普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×10^(3)拷贝/μL,表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR;该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及DuCV荧光定量PCR方法同时检测96份临床发病鸭的组织样品,该方法检测结果显示,共检出58份阳性样品,其中GPV检出率为18.75%(18/96),MDPV检出率为4.17%(4/96),DuCV检出率为37.50%(36/96),GPV与DuCV混合感染率为8.33%(8/96),阴性样品38份。与GPV和MDPV双重荧光定量PCR及DuCV荧光定量PCR方法的检测结果均一致,三者的符合率达100%。本研究建立的GPV、MDPV及DuCV多重TaqMan荧光定量PCR方法为临床鉴别检测该3种病原及其流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术手段。

鸭圆环病毒和鹅圆环病毒三引物鉴别检测方法的建立

【目的】建立一种可同时检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR方法。【方法】根据已发布的鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组分子特征设计3条引物,应用3条引物建立了一种在一个反应管中可检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的三引物PCR方法。【结果】该方法可特异性扩增鸭圆环病毒和鹅圆环病毒,并根据扩增片段大小鉴别病毒种类,检测最低限分别为110、80 pg·μL^(-1)。应用该方法对临床疑似病例样品进行检测,其结果与用2种病毒对应的单病毒PCR检测方法一致。【结论】建立的三引物PCR方法特异性强,敏感性高,丰富了水禽圆环病毒病的临床病例的诊断及流行病学监测的技术手段。

鸭圆环病毒ORF-C1基因的扩增及遗传进化分析

鸭圆环病毒(DuCV)感染能够引起鸭的免疫抑制,引起多种病原的继发性感染,在我国鸭群中广泛流行。为了解DuCV的遗传变异情况,对采自山东、江苏和贵州3个省份的19个鸭场的样品进行了PCR测定,并对DuCV的ORF-C1基因进行测序和遗传进化分析。PCR测定结果显示,19个鸭场中有9个鸭场的样品为DuCV阳性,总体阳性率为47.4%;ORF-C1基因序列测定结果显示,9株DuCV之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为93.4%~100%和82.2%~100%,与NCBI中已公布的DuCV毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为77.8%~99.5%和71.5%~-99.6%;遗传进化分析显示,9株DuCV全部属于DuCV-1b亚型,其中有7株在同一分支上,与D11-JW-001等韩国毒株遗传距离较近,另外2株则与山东、广西的毒株遗传距离较近;此外,与已公布的毒株相比,9株DuCV都在158位发生了氨基酸突变,由E/D变为L/P。上述结果表明,DuCV-1仍然为我国鸭群中的优势流行基因型,但病毒的基因也在不断地发生变异,应该对其进行持续监测。

鸭圆环病毒无核定位信号衣壳蛋白的原核表达及其在间接ELISA中的应用

鸭圆环病毒(DuCV)是一种具有长期免疫抑制特性的病原体,其Cap蛋白是DuCV的主要结构蛋白和主要免疫保护抗原,构成病毒的核衣壳,对DuCV的血清学诊断具有重要意义。为了开发出适合DuCV的检测方法,本研究在重组Rosetta大肠杆菌细胞内对无核定位信号的DuCV Cap蛋白进行了表达,建立了基于无核定位信号Cap蛋白检测DuCV血清抗体的间接ELISA方法(Cap-ELISA)。结果:Cap-ELISA包被抗原的最佳浓度为280 ng/孔,血清稀释比为1∶1600;检测样本的阴阳临界值为0.339,灵敏度达到1∶12800,并对DuCV抗体检测具有特异性;与常规PCR方法的符合率为92.7%,用Cap-ELISA对山东部分地区的樱桃谷鸭血清进行了间接ELISA检测,总阳性率为88.9%,说明该方法适合在DuCV血清学诊断中应用。

鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)和鸭圆环病毒(DuCV)的双重荧光定量PCR方法,试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列,分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示:建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应,对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL,批内和批间变异系数均小于2%,从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份,与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明,建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好,可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。

鸭圆环病毒的流行症状与防控

鸭圆环病毒是鸭类的一种新的传染病,破坏鸭的成长,对养殖户造成很大的经济损失,临床表现食欲下降、突发性脱毛、呼吸困难、免疫力低、与其他疾病混合感染。

广东佛山地区鸭圆环病毒分子流行株遗传变异分析

目的研究广东佛山地区鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况。方法采用常规PCR方法,对采自广东佛山的3份阳性鸭组织样品中扩增Rep基因部分片段和Cap基因,进行核苷酸序列测序,并将Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列与30株参考序列进行同源性比较和遗传变化分析。结果3份阳性样品分别扩增出相应的基因片段;Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列进化树和同源性分析显示,3株DuCV流行株与台湾株(AY3947213)在同一进化支,均属于DuCV-2型,与同分支的参考毒株相似性分别为97.2%~100%和96.9%~100%,2个基因型中Rep基因同源性高于Cap基因;氨基酸序列的变异分析表明,与中国台湾株(AY3947213)相比较,Rep部分氨基酸和Cap氨基酸分别发生相同位置的氨基酸置换和单独突变,Cap氨基酸突变位点多于Rep氨基酸。结论研究测得的3株DuCV流行株均属于DuCV-2型,在广东地区有一定范围的流行,且CAP蛋白的变异程度高于REP蛋白,为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据。

鸭圆环病毒病研究进展

近年来,鸭圆环病毒引起的鸭圆环病毒病对我国养鸭业危害严重。本文主要从病原学特征、基因组结构、致病机制、流行病学、临床症状、病理特征、诊断以及综合防治措施方面对鸭圆环病毒病进行了综述,以期为鸭圆环病毒病的研究方向和科学防治提供参考和借鉴。

鸭圆环病毒病流行趋势与防控要点

近些年我国鸭圆环病毒病的发生率在逐年增加,由于该病的单独发病几乎不造成鸭群死亡,表现生长缓慢,所以往往很多养殖户忽略该病,但是该病给鸭群造成的损失是巨大的,尤其鸭圆环病毒病是一种免疫抑制病,与其他病毒病和细菌病容易混合感染,鸭群的死亡率会明显升高,造成严重的经济损失,因此我们要对鸭圆环病毒病给予高度重视,做好相关的预防与治疗工作,减少鸭圆环病毒给鸭群带来的危害。

广西鸭圆环病毒的流行病学调查

为了解广西鸭圆环病毒(Du CV)流行情况,试验采用PCR技术对2010—2014年间采自南宁、柳州、桂林等10个城市活禽市场的2 897份临床健康鸭内脏组织样品进行检测,同时对采自83个鸭群的187份发病或死亡鸭组织样品分别进行Du CV、大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆菌(RA)、禽流感病毒(AIV)、鸭肝炎病毒(DHV)、副黏病毒(AMPV)、鸭坦布苏病毒(DTUMV)检测。结果表明:10个城市均检测出Du CV阳性样品,其平均检出率为8.01%(232/2 897);187份鸭组织样品中Du CV样品阳性率为20.32%(38/187),其中Du CV单纯感染仅占18.42%(7/38),而二重感染和三重感染的比率分别为50.00%(19/38)和31.58%(12/38)。说明Du CV在广西大部分地区鸭群中呈不同程度的流行,感染率逐年升高,且Du CV感染往往造成其他病原继发感染而引起鸭群发病甚至死亡。

鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析

为研究鸭圆环病毒全基因组的分子生物学特性,运用重叠PCR技术从鸭组织脏器提取的DNA中扩增出2条核苷酸序列,拼接后对其核酸组成、基因组结构及病毒的遗传变异进行分析。结果表明所获病毒核酸为大小1995nt的环型DNA,包含6个ORF,与登录在GenBank中克隆株MuDCV(AY228555)的同源性高达97·4%,可见所扩增的核酸序列为鸭圆环病毒基因组序列。

鸭圆环病毒感染的临床症状

圆环病毒是近年来倍受兽医界关注的新发现畜禽病毒之一,文章对源自福建、浙江、江西、广东等省主要养鸭区的病(死)鸭样品进行实验室病原学鉴定和鸭圆环病毒感染检测,同时对鸭圆环病毒感染的主要临床症状作一阐述。

鸭圆环病毒感染的检测

为明确鸭圆环病毒(DuCV)在鸭群中的感染情况,本研究通过PCR方法对2006～2009年间福建、浙江、江西、广东、山东等五省602例病、死鸭样品进行鸭圆环病毒检测。结果显示,15.28%(92/602)样品感染了鸭圆环病毒;40～60日龄的中鸭感染率明显高于其它日龄段;DuCV阳性样品中鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、鸭肝炎病毒1型和呼肠孤病毒感染率略高于DuCV阴性样品。

山东部分地区肉鸭群鸭圆环病毒血清学调查

为了解鸭圆环病毒(DuCV)在山东地区的流行情况,本研究采用已建立的间接ELISA(iELISA)方法对山东省潍坊和泰安两个地区的17个肉鸭场1 130份血清进行DuCV抗体检测。结果显示,肉鸭场的DuCV抗体个体阳性率为2%～78%,平均为29.91%(338/1130),群体阳性率为100%(17/17)。潍坊地区的抗体阳性率(42.81%)明显高于泰安地区(17.73%),显示DuCV在老养殖区鸭群中污染更加严重。

鸭圆环病毒感染的实验室诊断方法研究进展

鸭圆环病毒感染是由鸭圆环病毒引起鸭的一种以生长迟缓并有零星死亡为主要特征的免疫抑制病,常与其他病原体混合感染,给兽医临床诊断增加了难度。随着分子生物学与免疫学技术的日臻进步,鸭圆环病毒感染实验室诊断方法不断发展与完善。论文就近年来针对鸭圆环病毒感染的PCR、套式PCR、多重PCR、荧光定量PCR、LAMP、核酸探针、ELISA等实验室诊断方法的研究进展以及各种检测方法的优缺点进行综述,旨在为不同实验室寻找适合自己的检测方法以及发展新型检测方法提供参考,为鸭圆环病毒感染的诊断与综合防控提供合理的科学依据。