鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

表达鸭坦布苏病毒衣壳蛋白的重组腺病毒载体构建与鉴定

为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构建能够表达DTMUV Capsid和mHsp70蛋白的重组穿梭质粒pShuttle-DTMUV Capsid,并与含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-DTMUV Capsid。载体质粒经Pac I酶切线性化后转染至HEK 293A细胞,包装重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid。结果显示,rAdv-DTMUV Capsid在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达2.3×10^(8)PFU/mL。Western blot等结果表明rAdv-DTMUV Capsid在HEK 293A细胞中表达了DTMUV特异性蛋白Capsid。DEF细胞感染试验证明rAdv-DTMUV Capsid可感染鸭源细胞,且诱导IFN-α、IL-10和IL-17 mRNA表达。结果表明,研究成功制备表达DTMUV Capsid蛋白的重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid,能引起细胞免疫反应,可作为一种候选疫苗。

鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)膜前体蛋白(prM)的单克隆抗体,将原核表达的重组prM蛋白配伍佐剂免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌抗DTMUV prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3H4和5C10。2株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体,制备的腹水抗体效价分别为1∶51200和1∶102400。亚型鉴定结果显示,3H4和5C10单克隆抗体的重链均属于IgG2b,轻链均为Kappa型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,这2株单克隆抗体均能与BHK-21细胞中感染的DTMUV发生特异性反应,而与同属的日本脑炎病毒无交叉反应。微量病毒空斑减少中和试验结果表明,这2株单克隆抗体均具有中和活性。进一步原核表达prM蛋白不同截短体,发现2株单抗针对不同表位,均位于prM蛋白的pr片段上。本研究制备的单克隆抗体3H4和5C10为快速检测DTMUV感染和研究prM蛋白的结构与功能奠定了基础。

鸭坦布苏病毒E蛋白功能的研究进展

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)病是由DTMUV引起以病毒性脑炎(雏鸭、育成鸭)及产蛋下降(产蛋鸭)为主要特征的传染性疾病,该病的暴发和传播给水禽养殖业造成了巨大的经济损失。包膜蛋白E(Envelope,E)作为DTMUV关键的免疫原性蛋白,在介导病毒与宿主细胞融合、侵入等方面发挥作用。文章总结了近年来DTMUV E蛋白结构特点、关键毒力位点、潜在抗原表位、蛋白互作及生物制品等最新研究进展,以期为鸭坦布苏病毒病的特异性诊断、疫苗研究和抗病毒药物的设计提供参考。

鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备和治疗效果分析

为了制备、筛选和评价治疗鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染的中和抗体,本试验克隆DTMUV E基因,连接至原核表达载体pET-30a(+),转化至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态,提取质粒,鉴定重组质粒pET30-E,转化E.coli BL21感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析E蛋白表达,使用镍柱亲和层析纯化E蛋白,将E蛋白与弗氏佐剂混合、乳化,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠3次后,取小鼠脾脏,分离脾细胞,在聚乙二醇(PEG)的作用下,将脾细胞与SP2/0细胞融合,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选分泌抗E蛋白抗体的杂交瘤细胞株,通过Western blot进行单克隆抗体鉴定,通过间接免疫荧光技术检测DTMUV,病毒中和试验评价单克隆抗体中和DTMUV感染的能力,并评价单克隆抗体治疗DTMUV感染小鼠的能力。结果显示,含质粒pET30-E的E.coli BL21经诱导后可在裂解的沉淀物中表达E蛋白;制备的E蛋白单克隆抗体4A1可以与E蛋白发生免疫反应,不与鸭A型肝炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒和H9亚型禽流感病毒发生交叉反应;4A1株杂交瘤细胞株分泌的抗体对DTMUV具有中和活性,且能够很好地识别DTMUV并与之发生中和反应,可完全清除感染小鼠血液中的DTMUV。结果表明,本试验制备的单克隆抗体4A1在应对DTMUV感染方面具有潜在治疗价值。

鸭坦布苏病毒病病原学及其诊断方法研究进展

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)引起的一种以病毒性脑炎(雏鸭、育成鸭)及产蛋下降(产蛋鸭)为主要特征的传染性疾病。DTMUV所包含的3个结构蛋白和7个非结构蛋白,各有其重要功能,对于DTMUV致病机制和疫苗研究具有重要意义。目前,已有多种用于鸭坦布苏病毒病临床诊断或实验室检测的方法,如检测病毒颗粒的病毒分离鉴定和免疫组化,检测特异性蛋白或抗体的ELISA和胶体金免疫层析,以及检测病毒核酸的常规RT-PCR和荧光定量PCR等方法。本文就鸭坦布苏病毒病的病原学和诊断方法进行综述,以期为该病的深入研究和综合防控提供参考。

一例鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒混合感染樱桃谷肉鸭的病例报告

2023年8月,广西某养鸭场鸭子突发软脚、腿部肌肉震颤等神经症状,为探究该场鸭群致病病原,对该鸭场的患病鸭进行调查。剖检结果显示:患病鸭肝脏轻度肿大、质脆,呈黄褐色,肾脏肿大。病理切片显示:肝细胞胞质中可见微小圆形空泡,可见少量淤血;脾脏组织见较多细胞坏死,细胞核固缩。病原检测结果显示:鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭圆环病毒(DuCV)为阳性,细菌及其他病原检测结果为阴性。序列分析发现,该场流行的DTMUV与SCS01毒株遗传距离最近,属于Cluster 2.1;DuCV与山东毒株YF180401遗传距离最近,属于DuCV-1型,确定该养殖场鸭群突然发病为DTMUV混合感染DuCV所致。这两种病毒都是临床中常见危害鸭群的病原,但混合感染情况却少有报道。该研究旨在为我国今后开展DTMUV和DuCV的检测和综合防控提供参考。

鸭坦布苏病毒病的流行趋势和防控要点

鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒引起的一种传染性疾病,对肉鸭和蛋鸭造成很大的影响。它的主要特征包括发病急、传播速度快、死亡率高等。患病的鸭子通常会表现出站立困难、喜欢卧倒、头部颤抖等神经症状。疾病可持续1~2个月,并且淘汰率在15%~30%左右,甚至高达80%。

鸭坦布苏病毒病的流行特点和防控要点

鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒引起的一种传染性疾病,对肉鸭和蛋鸭造成很大的影响。它的主要特征包括发病急、传播速度快、死亡率高等。患病的鸭子通常会表现出站立困难、喜欢卧倒、头部颤抖等神经症状。疾病可持续1~2个月,并且淘汰率在15%~30%左右,甚至高达80%。疫情对蛋鸭产蛋率的影响尤为明显,可以迅速下降到10%以下,有些鸭场甚至会完全绝产,造成无法估量的养殖损失。

板蓝根水煎液对鸭坦布苏病毒感染雏鸭血清免疫指标的影响

为探究板蓝根水煎液对鸭坦布苏病毒感染雏鸭血清免疫指标的影响,试验以30只7日龄奥白星鸭作为研究对象,检测板蓝根水煎液对鸭坦布苏病毒感染雏鸭血清中的免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量。结果显示,在试验的第10天,试验Ⅱ组的IgA含量显著低于试验Ⅰ组(P<0.05);在试验的第15天,试验Ⅱ组的IgM含量显著高于试验Ⅰ组(P<0.05);在试验的第5天,试验Ⅱ组的IL-6含量显著高于试验Ⅰ组(P<0.05);在试验的第5天和第10天,试验Ⅱ组的IFN-γ含量显著高于试验Ⅰ组(P<0.05)。综上,板蓝根能够显著提升雏鸭的免疫能力。

鸭坦布苏病毒病的研究进展

鸭坦布苏病毒病会给养殖业带来较大的经济损失,该文简要介绍鸭坦布苏病毒病的病原、流行病学、临床症状、病理变化、诊断与防控等,以期为今后该病的深入研究和防控提供参考。

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗生产工艺的优化研究

为提升鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的产品质量,在全悬浮培养工艺生产病毒液的基础上,对病毒纯化工艺和佐剂进行研究。试验结果显示,采用新纯化工艺,通过深层过滤和超滤的方式处理抗原,抗原损失不超过0.2个滴度,抗原总蛋白下降到0.50mg/mL以下,有效去除80%以上杂蛋白;采用2种油佐剂(佐剂A和佐剂B)和1种水性佐剂(佐剂C)进行试验,佐剂B疫苗单次免疫后21日鸭坦布苏病毒HI抗体几何平均值达1∶320,攻毒保护率达10/10;进口佐剂B为优选佐剂,安全性和免疫效果均表现良好。

抗鸭坦布苏病毒感染的中草药筛选及其作用效果的初步研究

为筛选抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)的中草药并探究其抗病毒作用效果,本研究通过检测12种中草药对DTMUV感染鸭胚成纤维细胞细胞(DEF)形态学与病毒抑制率的影响,以及对DTMUV病毒滴度与病毒载量的影响,筛选在DEF中抗DTMUV效果较明显的中草药;采用鸭胚接种法测定筛选出的3种药物(板蓝根、醋五味子、酒黄芩)对DTMUV感染鸭胚死亡率的影响;并选择效果最好的酒黄芩验证其对DTMUV感染雏鸭死亡率、临床症状、体重及组织(心脏、脾脏)中病毒载量的影响。结果显示:鱼腥草、淫羊藿、金银花、板蓝根、绵马贯众、黄芪、酒黄芩、茵陈、甘草、连翘、醋五味子、白芍水提物在最佳作用浓度时均能减轻DTMUV感染DEF的CPE,并对DTMUV具有不同的抑制率,其中酒黄芩效果最佳;淫羊藿、白芍、板蓝根、黄芪、酒黄芩、茵陈、甘草、醋五味子、连翘能显著降低DEF中DTMUV的病毒滴度(P<0.05);板蓝根、醋五味子、酒黄芩能显著降低DEF中DTMUV的病毒载量(P<0.05);板蓝根、酒黄芩能起到治疗效果,且显著降低鸭胚死亡率(P<0.05),而酒黄芩、醋五味子还能预防病毒感染,且显著降低鸭胚死亡率(P<0.05);酒黄芩能够减轻病鸭临床症状,显著提高病鸭体重(P<0.05),显著降低病鸭死亡率及组织中病毒载量(P<0.05)。综上结果证明板蓝根、酒黄芩、醋五味子在细胞和鸭胚内具有一定抗DTMUV的作用,其中酒黄芩效果最佳,且酒黄芩对DTMUV感染的雏鸭具有治疗作用,可以成为抗DTMUV的潜在药物。

鸭坦布苏病毒E蛋白Domain Ⅲ单克隆抗体胶体金试纸条的创制及应用

为建立一种快速诊断鸭坦布苏病毒(DTMUV)的方法,以2株(B9D7B8G10和B9D10C7株)抗DTMUV的单克隆抗体制备DTMUV胶体金免疫层析试纸条。采用经典的柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液,利用rProtein G琼脂糖凝胶亲和层析法对两株单克隆抗体腹水进行纯化并鉴定;以纯化的B9D7B8G10株单克隆抗体作为标记抗体,通过调节单克隆抗体浓度与pH确定胶体金探针最佳结合条件;同时,在硝酸纤维素膜(NC膜)检测带包被纯化的B9D10C7株单克隆抗体,质控带包被山羊抗小鼠IgG抗体,建立检测DTMUV胶体金免疫层析试纸条;成功建立试纸条后,对试纸条敏感性、特异性、重复性和稳定性进行检测,并与RT-PCR检测方法进行比较,对200份临床疑似感染样品进行检测。结果显示:制备的胶体金试纸条在15 min内即可完成检测,最低检测稀释度为1:50,且不与鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅星状病毒、禽白血病病毒发生交叉反应;应用试纸条和RT-PCR方法分别对200份临床疑似样品进行检测,两者符合率达98%。结果表明,制备的胶体金试纸条敏感性高、特异性强、稳定性好、重复性好,为DTMUV的快速检测提供了一种实用检测技术。

鸭坦布苏病毒自然感染病例的诊断与病理学观察

为探究鸭坦布苏病毒(DTMUV)在贵州省鸭群的流行,对疑似DTMUV感染肉种鸭进行剖检,观察发病鸭内脏器官病变。取病鸭内脏组织进行RT-PCR检测确诊为DTMUV感染,将病料处理后接种BHK-21细胞,进行RT-PCR鉴定和透射电镜观察,确定分离到DTMUV,并将病料组织制作病理切片。结果显示,接种BHK-21出现明显CPE,电镜观察见病毒颗粒。将分离毒株的E基因经PCR扩增后测序,分析E基因氨基酸序列的同源性,发现所分离毒株与中国北京鸭源参考株同源性最高达99.39%,而与我国早期分离参考株(FX2010)同源性较低,将病料制作切片并进行HE染色,可见脑组织非化脓性脑炎,脾脏淋巴细胞减少,肝细胞变性坏死。本研究成功在贵州省分离到一株DTMUV,对其遗传进化进行分析,为探究贵州省养鸭地区DTMUV的感染和致病提供参考。

三种中草药对鸭坦布苏病毒感染雏鸭血清免疫指标与免疫器官指数的影响

为研究板蓝根、酒黄芩、醋五味子对鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染雏鸭血清免疫指标与免疫器官指数的影响,试验将150只7日龄DTMUV抗体阴性雏鸭平均分为5组:空白对照组、DTMUV对照组、板蓝根组、酒黄芩组和醋五味子组;饲养至15日龄时,除空白对照组外,其余各组接种DTMUV,同时三个药物组分别每日口服给药1 g/kg·bw,在接种病毒第3、6、9、12天对各组血清IgA、IgG、IgM、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(IFN-γ)含量及免疫器官指数进行检测。结果显示:DTMUV对照组在感染早期IL-2含量以及中后期IgA、IgM、IL-4含量显著低于空白对照组(P<0.05),接种病毒第3、6、9天IL-6含量均显著高于空白对照组(P<0.05);3个药物组接种病毒后第3、12天IgA含量,第9天IgM和IL-4含量均显著高于DTMUV对照组(P<0.05),板蓝根组在第3天能促进IgG表达,且显著高于其他组(P<0.05),板蓝根组、酒黄芩组在第9天能显著降低因病毒感染引起的IL-6含量上调(P<0.05);DTMUV对照组脾脏指数在试验期间显著高于空白对照组(P<0.05),且第6、9天胸腺指数以及第9、12天法氏囊指数显著低于空白对照组(P<0.05),3个药物组第12天脾脏指数显著小于DTMUV对照组(P<0.05),第12天法氏囊指数显著大于DTMUV对照组(P<0.05),醋五味子组第6、9天胸腺指数显著大于DTMUV对照组(P<0.05)。结果表明,板蓝根、酒黄芩、醋五味子可以不同程度地缓解DTMUV感染导致的鸭机体免疫抑制及免疫器官损伤,其中板蓝根及酒黄芩还能发挥抗炎作用,且板蓝根表现出更明显的免疫增强效果及免疫器官修复效果。

鸭坦布苏病毒E蛋白及其结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对DEF细胞周期与凋亡的影响

【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus,DTMUV) E蛋白全长及其结构域I、II和III (DI、DII和DIII)对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)的细胞周期与凋亡的影响。【方法】本研究设计、合成DTMUV E蛋白全长及其DI、DII和DIII真核表达质粒,并转染至DEF,用流式细胞仪检测不同蛋白引起的DEF细胞凋亡和细胞周期的变化。【结果】细胞凋亡结果显示:质粒转染细胞24 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是16.4%、15.1%、14.0%和17.2%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是23.4%、18.5%、26.7%和29.4%。细胞周期检测结果显示:E蛋白全长及DI、DII、DIII的质粒转染细胞24、36 h后,DNA合成期(S期)细胞比例都明显高于pEGFP-N1空载体转染组。质粒转染24 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为5.43%、22.58%、12.75%和12.80%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为9.98%、11.44%、10.44%和11.00%。【结论】DTMUV E蛋白全长及其3个结构域均能诱导早期细胞凋亡,引起细胞S期的停滞,但是各蛋白片段诱导细胞凋亡和引起细胞周期变化的能力存在一定差异。

鸭坦布苏病毒检测方法及疫苗研究进展

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的一种新发蚊媒病毒,其引起的疫病在临床上以蛋鸭产蛋量下降和雏鸭神经系统损伤为特征,给国内养鸭业造成了重大的经济损失。DTMUV感染自2010年在上海市暴发后,逐渐向中国东部、东南部和北部主要鸭养殖场扩散。目前国内已建立了多种用于DTMUV临床诊断或实验室检测方法。DTMUV的分离鉴定和免疫组化用于检测病毒颗粒的存在;DTMUV的血清学检测方法主要包括间接ELISA、竞争ELISA和胶体金免疫层析条等,可检测DTMUV的特异性蛋白或抗体,广泛应用于DTMUV的现场检测;以常规PCR、多重PCR及CRISPR技术为主的病毒核酸检测方法实现了DTMUV的快速临床诊断,促进了鸭坦布苏病毒病的流行病学调查和致病机制研究。随着部分疫苗的开发和商业化,中国DTMUV感染的流行强度也由暴发逐渐转变为零星散发。但DTMUV的宿主范围较广,传播途径多样且具有潜在的人畜共患性,为及早发现并控制DTMUV的传播,建立快速、准确的检测方法和安全有效的疫苗显得尤为重要。笔者对DTMUV的检测方法和疫苗研发的研究进展进行了综述,以期为DTMUV感染的防控提供参考。

鸭坦布苏病毒E蛋白生物信息学分析

鸭坦布苏病毒(DTMUV)是一种能造成蛋鸭产蛋下降的新型黄病毒,E蛋白是鸭坦布苏病毒主要的抗原蛋白。本试验利用Protparam、ProtScale等相关在线软件预测分析了E蛋白的理化性质、亲水性、跨膜螺旋区、信号肽、亚细胞定位、二、三级结构和T、B细胞抗原表位以及翻译后的修饰位点。结果表明,DTMUV E蛋白的分子式为C2405H3757N649O723S32,由501个氨基酸组成,理论等电点为7.63。该蛋白是定位于病毒衣壳中有2个跨膜螺旋区的稳定性、亲水性蛋白。分别由41.52%、19.96%、32.34%、6.19%的氨基酸参与E蛋白的无规律卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角的形成。三级结构预测模型蛋白覆盖率为100%。该蛋白含有18个潜在的糖基化修饰位点,52个潜在的磷酸化修饰位点,20个潜在的抗原决定簇,其中含有4个连续氨基酸数量超过10个的B细胞抗原表位。选取HLA_DRB1_0801亚型时,CD4+抗原表位有15个强结合肽,43个弱结合肽。对DTMUV E蛋白序列分析显示该蛋白是一种没有信号肽,有跨膜区,具有良好免疫原性的亲水性蛋白,该结果为对E蛋白功能的进一步研究奠定了理论基础。