鸭甲型肝炎病毒的遗传和抗原稳定性分析

本研究测定了实验室保存的25株(2000年～2017年)鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)和32株(2008年～2017年)鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)的VP1基因序列,利用生物信息学软件对其以及Genbank中下载的DHAV的VP1基因进行遗传进化关系分析,并选取代表毒株进行血清中和试验,分析DHAV-1或DHAV-3的遗传和抗原稳定性。结果表明,DHAV-1进化为2个遗传分支,2016年～2017年的分离毒株分布在同一分支上;DHAV-3进化为2个不同的分支,2008年～2017年分离毒株集中在相同分支上,又进一步进化为不同的亚分支;DHAV-1或DHAV-3毒株之间无明显的地理分布差异。血清交叉中和试验结果表明,DHAV-1或DHAV-3同一血清型之间具有较好的交叉保护,表明同一血清型的DHAV未发生抗原变异。本研究揭示了DHAV-1或DHAV-3的遗传进化特点和相同血清型之间的抗原稳定性。

血清3型鸭甲型肝炎病毒弱毒疫苗株培育及免疫原性研究

近年来鸭甲型肝炎病毒血清3型引起的小鸭肝炎在我国广泛流行,严重危害着肉鸭养殖业。本研究采用鸭胚连续传代对血清3型鸭甲型肝炎病毒分离株进行致弱,通过检测不同代次的鸭胚组织毒的毒力、稳定性及免疫原性,结果发现该病毒在鸭胚中连续传代至第53代以后对雏鸭无致病性,在雏鸭体内连续继代不出现毒力返强。雏鸭经颈部皮下接种5×105.9ELD50的第54代病毒后可刺激机体产生坚强的免疫力。1日龄雏鸭免疫后4 d对强毒感染的保护指数为81.4%,免疫后6天的保护指数为100%。3日龄雏鸭免疫后5 d攻毒保护率为100%。1日龄雏鸭免疫后1周,血清中和抗体水平为10-3.29,至第4周达到高峰,之后开始缓慢下降。试验结果表明,3型鸭甲型肝炎病毒株第54代弱毒具有良好的免疫原性、毒力稳定,雏鸭接种后诱导产生的免疫力完全可以保护小鸭渡过鸭肝炎易感期。

鸭甲型肝炎病毒1型3C基因的原核表达与多抗的制备

以血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3C基因为序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法进行扩增,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下重组蛋白并获得成功表达,该重组蛋白分子量约为38 ku,能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,经Western-blot分析证明,制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。3C基因在大肠杆菌中可获得成功表达,制备的多抗血清可用于3C蛋白的检测。

鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型3D基因在昆虫细胞中的表达及抗原检测

通过高保真PCR方法扩增出鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型(DHAV-Ⅰ)RNA依赖的RNA聚合酶3 D基因,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1中,构建重组杆状病毒转移载体pFB-3D,将其转化感受态细胞DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-3D,转染昆虫细胞Sf9,收获重组杆状病毒rBac-3D,通过间接免疫荧光、Western blot对重组蛋白的表达水平进行检测。结果表明:间接免疫荧光数据显示表达的重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性结合,Western blot表达的重组蛋白分子量约为51ku,与理论值相符。这一研究说明3D蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为DHAV-Ⅰ型ELISA检测试剂盒的研制提供了技术基础。

1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。

鸭甲型肝炎病毒的遗传演化分析

本研究测定了实验室2018~2019年分离的11株鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)和37株鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)的VP1基因序列,并选取代表毒株与已知阳性血清进行中和试验,分别分析DHAV-1或DHAV-3的遗传和抗原稳定性。结果表明,DHAV-1进化为两个遗传分支,2018~2019年的分离毒株分布在1b分支上,而经典DHAV-1毒株处于不同的1a分支上。DHAV-3进化为两个不同的分支,2018~2019年分离毒株大部分集中在3a分支上,个别毒株分布在3b分支上。DHAV-1或DHAV-3毒株之间均无明显的地理分布差异。血清交叉中和试验结果表明,DHAV-1或DHAV-3同一血清型之间仍具有较好的交叉保护,表明同一血清型的DHAV尚未发生抗原变异。

22株鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

为了解鸭甲型病毒性肝炎的病原特征,对2017—2019年从山东省采集的27份疑似鸭肝炎病毒感染的病料采用鸡胚进行病毒分离,并进行RT-PCR鉴定,随后对分离株的VP1基因进行序列测定以及遗传变异分析。结果显示:从27份疑似病料中共分离出了22株病毒,8株为鸭甲肝病毒1型(DHAV-1),14株为鸭甲肝病毒3型(DHAV-3);VP1基因序列比对显示:8株DHAV-1与12株参考株的核苷酸相似性为91.7%~98.6%,氨基酸相似性为93.7%~97.5%,分离株的核苷酸相似性为97.2%~100%;14株DHAV-3与12株参考株的核苷酸相似性为89.4%~98.9%,氨基酸相似性为92.1%~100%,分离株的核苷酸相似性为93.9%~100%,属于Ⅰ型(GⅠ型)。研究结果将为鸭甲型病毒性肝炎的防控提供了参考。

基因A型和C型鸭甲型肝炎病毒卵黄抗体的研制及应用

旨在研制基因A型和C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV)单价及二价高免卵黄抗体,以满足实际生产中基因A型和C型DHAV单独或混合感染防控的需要。采用基因A型和C型DHAV强毒株作为抗原制备单价和二价油乳剂灭活疫苗免疫接种高产蛋鸡,制备了高效价的基因A型和C型DHAV单价及二价高免卵黄抗体,卵黄抗体鸭胚中和效价在1∶204与1∶281之间,单价及二价卵黄抗体防治试验证明,所制备的卵黄抗体防治效果良好。

鸭干扰素诱导的跨膜蛋白抑制基因3型鸭甲型肝炎病毒的增殖

旨在研究鸭干扰素诱导的跨膜蛋白(duck interferon-induced transmembrane proteins,duIFITMs)和相关细胞因子在鸭甲型肝炎病毒3型(duck hepatitis A virus genotype 3,DHAV-3)感染早期的变化规律,以及duIFITMs对DHAV-3的抑制作用,本研究对DHAV-3感染早期雏鸭肝中mRNA进行高通量测序分析,通过Real-time PCR验证duIFITMs及其相关细胞因子的变化;分别用pEGFP-duIFITM1和duIFITM1-siRNA构建duIFITM1过表达和敲减的鸭胚肝原代细胞(duck embryo liver cell,DELC)模型,通过该模型评价了duIFITM1对DHAV-3增殖的影响。结果显示:转录组测序分析及验证结果均表明,DHAV-3感染雏鸭后24和36 h duIFITM1显著上调(P<0.01),IFITM5无明显变化。进一步用DHAV-3感染duIFITM1过表达和敲减的DELC细胞,与对照组和敲减组相比在过表达细胞中,在48、60 h DHAV-3拷贝数和病毒滴度均明显下降(P<0.01)。此外,经转录组测序分析共筛选出211个与抗DHAV-3免疫反应相关分子和74条显著富集的信号通路。经Real-time PCR检测,在攻毒后12和24 h肝中RIG-I和MDA5的表达水平与对照组差异不显著,但在36 h上调到对照组的4.23倍(P<0.01)和3.61倍(P<0.05),这与IFN-α/IFN-β早期表达滞后的趋势也恰好一致。同时,感染早期IRF1和IRF3的表达水平也显著上调。本研究首次探明duIFITM1对DHAV-3具有抑制作用,为以此开发新型抗病毒药物奠定了基础。对抗病毒感染早期的多个关键免疫分子表达变化规律的系统研究分析,可为DHAV-3感染与免疫的分子机制研究提供重要参考。

识别不同亚型鸭甲型肝炎病毒VP0蛋白单克隆抗体的制备及表位鉴定

为制备鸭甲型肝炎病毒(DHAV)VP0蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验经PCR扩增DHAV-1和DHAV-3的VP0基因并克隆至原核表达载体pMAL-c5x中分别构建重组质粒pMAL-c5x-DHAV1-VP0和pMAL-c5x-DHAV3-VP0。重组质粒均经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导表达,并经亲和层析的方法纯化后,采用SDS-PAGE检测两个重组蛋白的表达与纯化效果。SDS-PAGE结果显示,分别在约70 ku处出现目的条带,且纯化后的条带较单一。表明两种重组VP0蛋白(DHAV-1 rVP0和DHAV-3 rVP0蛋白)均获得了表达,且纯化效果均较好。采用纯化的DHAV-1 VP0和DHAV-3 VP0蛋白交叉免疫BALB/c小鼠4次,并在冲击免疫后3 d收获小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选能够稳定分泌DHAV-1 VP0及DHAV-3 VP0蛋白抗体且MBP蛋白抗体为阴性的杂交瘤细胞株,采用试剂盒鉴定MAb的亚类。结果显示,获得了针对DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的MAb 1H10,且其为IgG1亚型,轻链为κ链。将构建的表达DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的重组真核表达质粒经PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T细胞,24 h后以该MAb作为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。结果显示,转染两种重组质粒的细胞均在35 ku处出现特异性条带,且细胞中均出现特异性绿色荧光,而转染空载体的对照细胞无该条带和绿色荧光。表明制备的MAb可以用于western blot和IFA鉴定DHAV-1和DHAV-3 VP0蛋白的表达。通过对VP0基因截短表达并采用western blot鉴定其识别的抗原表位,并对该表位的氨基酸序列与NCBI数据库中VP0蛋白的氨基酸序列比对。结果显示,MAb 1H10识别的线性表位为VP0蛋白的184LRTNTEIDL192,该表位与不同年代和不同地域分离的DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白相应氨基酸序列的同源性均为100%。表明该抗原表位在不同DHAV分离株中的保守性很高。本研究为DHAV检测方法的建立及具有广谱保护性表位疫苗的设计提供实验参考。

鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)和鸭圆环病毒(DuCV)的双重荧光定量PCR方法,试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列,分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示:建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应,对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL,批内和批间变异系数均小于2%,从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份,与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明,建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好,可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。

鸭甲型肝炎病毒3型对商品肉鸭的致病性研究

为了解鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)对商品肉鸭的致病性,利用DHAV-3型强毒株SD20株滴口接种10日龄雏鸭,对攻毒后死亡雏鸭的组织病变进行了观察,并对攻毒后24和48 h雏鸭的血清生化指标进行了测定。结果显示:DHAV-3对雏鸭的致死率达85%,对肝脏等组织造成广泛的病理损伤,同时严重影响感染肉鸭的血清生化指标。攻毒后24 h,鸭血清中直接胆红素显著性降低(P<0.05),γ-谷氨酰转移酶和肌酐显著性升高(P<0.05);攻毒后48 h,鸭血清中白蛋白、直接胆红素显著升高(P<0.05),白球比、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转移酶、尿素氮和肌酐均极显著升高(P<0.01),谷丙/谷草和血糖均极显著下降(P<0.01),而总蛋白、球蛋白、总胆红素、间接胆红素、碱性磷酸酶指标变化不显著(P>0.05)。研究结果提示,DHAV-3对商品肉鸭致病性较强,养殖过程中需要积极预防。

鸭甲型肝炎病毒1型的鉴定及防治研究进展

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)是一种具有高度接触性和高致死率的传染病,主要病原为鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A viral,DHAV)。其特点是肝空泡增多、肝坏死和出血。幼雏鸭感染后的病死率可达95%以上。鸭甲型肝炎病毒可分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3共3种血清型,其中DHAV-1最广泛且毒性最强。为准确、高效、特异地鉴定DHAV,建立一系列检测方法。目前较为常用的是间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)。对DHAV-1的防治早期多使用灭活苗和弱毒苗,但是并未达到理想的免疫效果。近年来,很多研究集中于基因工程疫苗及中药的应用,对于防治DHAV-1具有很好的前景。

鸭甲型肝炎病毒衣壳蛋白B细胞抗原表位和密码子偏爱性的分析

为了筛选血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV)衣壳蛋白的优势B细胞抗原表位及其各结构蛋白的最佳宿主表达系统,通过RT-PCR获得DHAV衣壳蛋白的编码基因(P1基因)序列,并分别运用DNAStar和EMBOSS软件分析其B细胞抗原表位区和密码子偏爱性特征,然后进行各结构蛋白抗原性的Western-bolt分析以及与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性进行比较。结果显示,DHAV的优势B细胞抗原表位主要存在于VP1和VP3蛋白,且每种蛋白各包含2个潜在的优势B细胞抗原表位。DHAV 3种结构蛋白基因的ENc值分别为54.631、49.502和45.924。VP3和VP1蛋白与酵母的密码子偏爱性差异最小,VP0蛋白与人的密码子偏爱性差异最小。结果表明,3种结构蛋白密码子出现的频率较为均一。VP1和VP3蛋白均是DHAV基因工程疫苗研制的候选免疫原,且适宜在酵母表达系统中表达,而VP0蛋白更适宜在人源细胞中表达。

表达1型和3型鸭甲型肝炎病毒VP1基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性

为进一步研发安全有效的鸭甲型肝炎病毒(DHAV)多价疫苗,本研究以新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株为载体,构建出共表达DHAV-1和-3型VP1基因的重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1,并对其毒力、生物学特性进行鉴定。通过间接免疫荧光试验(IFA)验证DHAV-1和-3型VP1蛋白在细胞内能够有效表达。利用Western blot进一步验证重组病毒产生的中和抗体能和DHAV-1和DHAV-3VP1表达蛋白发生较强的反应。重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1保持了原重组疫苗株rLS-RFP对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。将重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1免疫种鸭1次,通过中和试验检测该重组病毒能够在鸭体内产生针对DHAV-1和DHAV-3的中和抗体,平均效价分别为1∶18.17和1∶16.60。本研究结果表明重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1具有作为鸭肝炎重组病毒活载体疫苗用于种鸭的潜力。

检测鸭甲型肝炎病毒3型的免疫组织化学方法的建立和应用

收集鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV3)接种10日龄鸭胚后死亡胚体的尿囊液,用差速离心法获得纯化的DHAV3抗原免疫家兔后制备家兔抗DHAV3超免疫血清,提取家兔抗DHAV3IgG,成功建立和优化了检测DHAV3的免疫组织化学方法。该法能够检测DHAV3感染雏鸭肝组织的病毒抗原,阳性信号主要分布于受感染细胞的细胞质,而用它检测鸭瘟病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病死亡雏鸭和健康雏鸭时则呈现阴性反应。应用该方法对临床确诊并经福尔马林溶液保存的5份DHAV3感染雏鸭的肝、脾、肾、小肠、法氏囊、哈氏腺、胸腺的样品进行检测,结果均为阳性。以上试验结果表明,该方法具有良好的特异性,可用于DHAV3感染雏鸭的临床诊断和福尔马林溶液固定样品的回顾性诊断。

鸭甲型肝炎病毒JS2013株的鸭胚适应性与基因组分析

鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）是引起雏鸭病毒性肝炎的主要病原之一。本研究将2013-2015年分离的5株DHAV进行了鸭胚传代复苏,发现JS2013株的鸭胚适应性最好,可导致鸭胚在接毒后2-5d出现有规律的死亡。应用血凝试验和PCR方法进行了鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭瘟病毒（DPV）和鸭圆环病毒（Du CV）等的检测,结果均为阴性。将DHAV JS2013株继续在鸭胚传代并测定其病毒滴度,发现其在5至8代之间病毒滴度稳定提升,第8代病毒的ELD50为10-7.5/0.1m L,但8至20代没有出现有规律的病毒滴度提升。为了揭示DHAV JS2013株的基因组特征,应用RT-PCR方法分9段扩增了病毒基因片段,通过序列拼接获得了全基因组序列,Gen Bank登录号为KP721458。同源比对发现,与DHAV JS2013株基因同源性最高的毒株属于基因I型DHAV。将其编码多聚蛋白的序列与同源性最高的10株已登录序列的DHAV毒株进行比对,发现存在8处氨基酸位点变异。该研究探明了DHAV JS2013株在鸭胚的增殖特性及其基因特征,为研制新型鸭肝炎病毒灭活疫苗奠定基础。

鸭甲型肝炎病毒的研究进展

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis, DVH)主要是由鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus, DHAV)引起的一种高度接触性和致死性的传染病,以肝脏出血肿大、肝空泡增多和神经症状为基本特征。近年来,病毒变异导致其致病性的改变为该病的诊断和防控带来了巨大挑战。对DHAV的分子生物学特征、病毒引起的流行与传播、病理变化、致病机制以及该病的诊断与防控等方面进行综述,将为今后该病的诊断和预防提供科学依据。

一株江苏新型鸭肝炎病毒的鉴定

对江苏地区分离到的1株疑似鸭肝炎病毒毒株（JS株）进行传代繁殖、雏鸭回归试验和理化性能测定,结果表明,该毒株能在鸭胚上进行传代繁殖,E1-E6代鸭胚毒的ELD50为104.38·0.2 m L^-1-106.17·0.2m L^-1;攻毒的雏鸭可产生与I型鸭肝炎病毒相同的症状和病变;3,7,14日龄易感雏鸭的LD50分别为105.5·0.2 m L^-1,105.17·0.2 m L^-1,103.83·0.2 m L^-1;病毒对氯仿、乙醚和胰酶不敏感,对酸（p H 3.0）稳定,对热不稳定。进一步进行交叉中和试验、交叉被动保护试验和VP1基因序列分析,结果显示,该毒株的抗原性与经典1型DHV差异显著;VP1序列与多株1型DHV的同源性在69.3%-93.3%;从进化关系来看,与韩国株的亲缘性最近。JS株属于我国流行的新型鸭肝炎病毒（命名为N-DHV-JS株）。

一例鸭病毒性肝炎与大肠杆菌混合感染病例的诊断

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)是一种由鸭甲型肝炎病毒(DHAV)引起的致死率高达100%的急性传染病,常引起雏鸭患病[1]。主要侵害3周龄以下的雏鸭,是致死率高、传播快的传染性疾病,以肝出血、肿大和角弓反张为主要特征[2]。是严重危害我国鸭养殖业的的重要疾病之一。目前我国主要流行的鸭病毒性肝炎为DHAV-1型与DHAV-3型。