实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测鸭甲肝病毒Ⅲ型方法的建立及初步应用

研究旨在建立一种检测鸭甲肝病毒Ⅲ型的实时荧光定量TaqMan RT-PCR技术。以鸭甲肝病毒Ⅱ型(DHAV-Ⅲ-SD22株)RNA为模板,建立检测鸭甲肝病毒Ⅱ型的实时荧光定量RT-PCR方法。制备含有上述DHAV-Ⅱ目的片段的RNA作为标准品,以10倍比稀释的DHAV-Ⅲ标准品建立标准曲线,测定敏感性。同时采用5个稀释度的标准品验证该方法的批内和批间重复性,并与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测。结果:建立的实时荧光定量TaqMan RT-PCR方法仅在鸭甲肝病毒Ⅱ型RNA样本中检出荧光信号。最低检出量为1.267×10^(2)copies/μL,敏感性良好,是常规PCR的100倍;线性范围达10个数量级。该方法重复性良好,批内和批间的变异系数均在1%以下。经试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于临床样本中DHAV-Ⅰ和DHAV-Ⅱ的鉴别诊断。