鸭病毒性肠炎的诊断和防治

鸭病毒性肠炎又叫鸭瘟,是一种急性败血性传染病,传染性强,发病快,死亡率较高,严重损害养殖户经济效益。1流行特点鸭病毒性肠炎一年四季均可发生,春秋季节发病率较高,该病可发生于所有品种的鸭,麻鸭、番鸭更易感,主要传染源是病鸭、病鹅和病野生水禽,病毒存在于内脏、血液和排泄物中,可以污染饮水、饲料和生活环境,健康鸭经消化道、呼吸道和接触感染,成年鸭的发病率高于雏鸭,1月龄以下雏鸭较少发病,但雏鸭免疫力低,发病后死亡率高。

福州地区鸭病毒性肠炎的血清学调查与分析

为了解福州地区鸭病毒性肠炎的免疫情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对福州地区14个鸭场291份血清样本进行调查分析。调查的14个养鸭场鸭病毒性肠炎病毒(DEV)抗体水平总阳性率为39.5%,均未达到国家规定的合格率标准,其中阳性率最高的养鸭场DEV抗体阳性率为100.0%,最低的养鸭场DEV抗体阳性率为0.0%。不同县区DEV抗体阳性率差距较大,最高的县区DEV抗体阳性率高达78.9%,最低的县区为0.0%。调查发现,春、秋、冬三季的DEV抗体水平均较低,仅夏季符合国家标准。建议养殖户加强对该病的重视、定期检测抗体水平,优化免疫程序,加强日常防疫和饲养管理,确保养殖业生产安全。

鸭病毒性肠炎病毒基因文库的构建及其核衣壳蛋白基因的发现、克隆与鉴定

提取鸭病毒性肠炎病毒（DEV）基因组DNA,超声波处理使其片段化,经补平末端后,分级分离并收集各部分DNA片段,与质粒pBluescript Ⅱ SK（＋）连接,转化大肠杆菌DH5α,成功构建了DEV基因文库.随机选取文库中的重组质粒测序分析,DNA序列拼接后获得大于100bp以上ORF共187个,将其中一个含完整ORF的DNA片段,以BLASTX软件与Genbank上相应基因进行比对分析,初步确定为一种核衣壳蛋白基因.根据该基因片段序列,设计引物对DEV DNA进行PCR扩增,并克隆到pGEM-T载体上,转化宿主菌JM109,提取阳性重组质粒,经PCR检测、酶切鉴定、测序和生物信息学分析,确定该基因片段为DEV核衣壳蛋白基因.

鸭病毒性肠炎病毒荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因保守序列设计TaqMan探针,建立了检测 DEV的荧光实时定量PCR方法,用该法对DEV在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的增殖进行了检测。结果显示,DEV接种DEF 22 h后开始释放,第50 h病毒在细胞和上清中的含量增幅均为1×103 左右,病毒主要存在于细胞中,其含量是上清的1×102-1×103倍。

检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立

【目的】建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒(DEV)核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎(DVE)存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段。【方法】据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测。【结果】间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌病和鸭大肠杆菌病死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对人工感染DEV后2、4、6、12、24、48和72 h不同时间的鸭肝脏检测结果均为阳性,阳性细胞有肝细胞、窦皮细胞和枯否氏细胞,阳性信号多出现于坏死细胞的碎片中或细胞坏死后形成的空泡内及空泡边缘;对存档蜡块、临床病料的检测与病毒分离鉴定吻合率为100%。【结论】本研究建立的间接原位PCR方法具有直观、敏感、特异性强的优点,在显示核酸阳性信号的同时,还能判别含有靶序列的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。可用于DVE的诊断、分子流行病学调查、存档蜡块的回顾性诊断和致病机理的研究。

用间接免疫荧光染色法检测鸭病毒性肠炎病毒在人工感染鸭体内的侵染过程和分布规律

用鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CHv强毒株感染成年鸭复制鸭病毒性肠炎急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、食道、十二指肠、胰腺、法氏囊和脑组织,制作切片,应用间接免疫荧光染色法(IFA)检测DEV在鸭体内的侵染过程和分布规律。结果显示:感染后4 h可在脾脏、胸腺和法氏囊中检测到DEV抗原;感染后6 h可在肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏检测到DEV抗原;IFA对各组织器官中DEV的平均检出率为肝脏46/50、脾脏48/50、肺脏46/50、肾脏0/50、肠道46/50、法氏囊46/50、胸腺47/50、胰腺0/50、大脑0/50、食道44/50、心脏0/50。研究表明:在急性病例中,脾脏、法氏囊、胸腺、食道、肠道、肝脏和肺脏为DEV的主要靶器官;接种后,病毒首先在脾脏、胸腺、法氏囊中出现,然后病毒迅速传播到肝脏、消化道和肺脏中;IFA检测石蜡切片中DEV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的较好方法。

间接免疫荧光染色检测石蜡切片中的鸭病毒性肠炎病毒和抗原定位

差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化鸭病毒性肠炎病毒(DEV)免疫兔制备兔抗DEV高免血清后,用DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化的兔抗DEVIgG建立了间接免疫荧光染色法(IFA)检测石蜡切片中DEV的方法。IFA的最佳条件为:石蜡切片用10mmol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液为微波修复液微波修复10min,胰酶修复20min;10%小牛血清室温封闭30min;加入1∶25的兔抗DEVIgG于4℃孵育过夜;再加入FITC标记的羊抗兔IgG于37℃孵育45min。以建立的IFA对DEV人工皮下感染死亡鸭的各组织器官进行检测,在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏中检测到DEV抗原。研究表明,IFA检测石蜡切片中的DEV具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的良好方法。

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株在鸭胚成纤维细胞中形态发生学的研究

采用超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的形态发生学进行了研究。结果表明,DEV-CHv吸附到DEF细胞上以后通过囊膜和细胞膜间发生融合的方式侵入宿主细胞;病毒在细胞核内完成病毒核酸的生成、核酸与衣壳的装配;病毒核衣壳通过核膜-内质网膜系统从细胞核转运到内质网池中并在内质网池中得到皮层结构;获得了皮层的DEV-CHv核衣壳通过出芽方式释放到细胞空泡内得到囊膜结构后成为成熟病毒;细胞空泡内的成熟DEV-CHv可通过细胞的胞吐作用被释放到细胞外,或在空泡破裂时被释放到细胞外。

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构观察

通过超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CH强毒株在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的形态结构进行了研究.结果发现,DEV CH强毒株病毒核酸呈圆形颗粒状,直径35～45 nm,在胞核内常集中分布;病毒核衣壳呈圆形,直径90～100nm,在胞核和胞浆内都有分布;DEV核衣壳可根据所含核酸形态的差异分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳;成熟的病毒粒子具有囊膜和皮层结构,呈圆形,直径150～300nm,存在于胞浆空泡内;DEV可在DEF中分别形成胞浆内和胞核内包涵体结构;伴随子代病毒在细胞内的出现,胞浆内还出现豆荚状、马蹄形、半圆形、圆形、同心圆形等与病毒发生有关的电子致密结构.

鸭病毒性肠炎病毒基因组异构体的研究

为研究鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组异构体的存在形式,本研究在已建立的以pCC1FOS为载体的DEV疫苗株基因文库基础上对DEV全序列进行了测定,并进一步对DEV基因组的异构体进行了研究。对261个重组fosmid中的DEV基因组片段的末端序列进行测序及序列分析,初步证明了DEV基因组有3种异构体,即P型、IS型和ILS型,未发现IL型的存在。并且,以上3种异构体在基因组中所占比例分别为77.1%、8.6%和14.3%。通过对11个重组fosmid的全序列测定,进一步确认了以上3种异构体的存在。该结果为DEV的分类提供了重要实验依据。

人工感染鸭病毒性肠炎急性病例超微结构变化

用鸭病毒性肠炎病毒(Duck en teritis v irus,DEV)CH强毒株感染成年鸭复制鸭病毒性肠炎急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、肾、脾、胸腺、十二指肠、法氏囊、脑和胰组织,制作超薄切片,电镜观察。结果表明:病变最早发生于肝和肾,而鸭死亡后以免疫器官和消化器官损伤最严重;各种细胞的变化主要表现为细胞肿胀,染色质或浓缩、碎裂或溶解,线粒体溶解成空泡样结构,其他细胞器破坏;脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞在感染24 h后,在出现细胞坏死的同时还出现较为明显的细胞凋亡变化;而鸭死亡后淋巴细胞主要表现为黑洞核样变化,整个细胞凝聚深染,染色质固缩,细胞浆均质深染,细胞膜模糊或不完整。

实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎标准方法的建立

根据GenBank（登录号：EF417996）中鸭病毒性肠炎病毒U31基因的序列，设计了1对特异性引物及TaqMan探针，扩增片段长度为76bp。以鸭病毒性肠炎弱毒疫苗株DNA为阳性标准品模板，建立了实时荧光定量PCR检测鸭病毒性肠炎病毒的方法。该方法能在鸭病毒性肠炎病毒DNA样本中检出荧光信号，定量范围为：2．1×10^0～2．1×10^0个拷贝数，最小检出量为2．1×10^0个拷贝；用该方法对人工感染试验的4只鸭组织器官、粪便、血液等样品重复测定3次，病毒模板DNA的检出率为100％，对鸭正常组织、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌和鸭病毒性肝炎、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟病毒等DNA检测不出现特异性荧光信号。经过重复性和实际临床样本检验证实，该方法真实可靠，而且从核酸提取到报告检测结果耗时不超过4h，不仅实现了对鸭病毒性肠炎的快速诊断，也实现了对该病毒DNA由定性到定量的检测。

人工感染鸭病毒性肠炎急性病例细胞凋亡的电镜研究

应用透射电镜和超薄切片技术观察鸭病毒性肠炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)CH强毒株人工感染成年鸭各组织器官的形态学特征。结果表明,脾脏、胸腺、法氏囊、十二指肠固有层中淋巴细胞除了坏死变化外还有很明显的凋亡变化,两者往往同时存在。疾病过程中,淋巴细胞凋亡数量明显增多。凋亡细胞的形态学改变是细胞体积缩小,细胞器结构正常,染色质初期浓集成团,聚集于核膜的周边,随后出现染色质凝聚,核碎裂以及凋亡小体形成等现象。淋巴细胞的坏死和凋亡共同造成了淋巴细胞的大量损耗,淋巴细胞的这种变化可能在鸭病毒性肠炎的发病机制中起着重要的作用。研究结果表明DEV急性感染可诱导成年鸭体内淋巴细胞的凋亡。

鸭病毒性肠炎病毒致鸭胚成纤维细胞发生凋亡作用的研究

研究通过HE染色镜检发现,鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)可致鸭胚成纤维细胞(DEF)出现染色质颗粒化、细胞核变形等显著凋亡特征;TUNEL试验显示,接毒组细胞核内有多量棕黄色DAB显色颗粒,表明细胞出现了凋亡现象;DNALadder检测表明,接毒组细胞具有分子量分别为180～200bp及其整数倍的凋亡梯带电泳图谱特征;电镜观察发现,接毒组细胞具有染色质浓缩、边移,胞浆严重空泡化,细胞核严重变形,形成凋亡小体等典型凋亡特征。上述研究结果表明鸭病毒性肠炎病毒具有显著的致鸭胚成纤维细胞发生凋亡的作用。

鸭病毒性肠炎病毒河南株gI基因的克隆与同源比较

鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis，DVE）俗称鸭瘟（Duck plague，DP）是由鸭病毒性肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的，鸭、鹅和其它雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。

鸭病毒性肠炎间接ELISA诊断方法的建立及应用

本研究以鸭病毒性肠炎(DVE)病毒作为包被抗原,建立了检测DVE抗体的间接ELISA诊断方法。应用该ELISA诊断方法检测DVE阳性对照血清,当血清稀释至12800倍时,结果仍为阳性;检测其它7种鸭病阳性血清结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于10%;该检测方法与血清中和试验的符合率为100%。DVE活疫苗皮下免疫鸭抗体监测结果表明:鸭免疫后第7d可以在血清中检测出DVE特异性抗体。本试验建立的诊断方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为DVE免疫鸭的抗体监测和DVE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

鸭病毒性肠炎gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

利用DNAStar分析并筛选出鸭病毒性肠炎病毒gB基因的两段主要抗原区域,PCR扩增出这两段主要抗原区域并克隆进入载体pMD18-TVector,目的基因经PCR和酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a(+)。获得的重组质粒分别转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-bloting及免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。

鸭病毒性肠炎的防治

鸭病毒性肠炎又称鸭瘟,俗称＂大头瘟＂,是由鸭瘟病毒引起的一种急性败血性传染病,以高热、头颈肿大,流泪,下痢,排绿便,两腿软弱无力为特征。传染速度快,发病率较高,死亡率〉40%,严重威胁养鸭业的发展。1流行特点病鸭、潜伏期的鸭、带毒鸭、带毒的水禽、鸟类、污染的饲料、饮水、用具、分泌物等是主要的传染源。通过消化道、交配、眼结膜、血吸虫、呼吸道、免疫接种等传播感染。不同年龄、品种和性别的鸭均可感染。

靶向cofilin2基因RNAi对鸭病毒性肠炎病毒增殖的影响

旨在探讨cofilin2基因的表达在鸭病毒性肠炎病毒(DEV)增殖过程中的影响。本研究通过已获得的鸭源cofilin2全基因序列(GenBank登录号:MF434775),设计出4对shRNA序列,插入载体中,并转染到鸭胚成纤维细胞中,经FQ-PCR方法和荧光显微镜观察筛选出具有较高干扰效率的shRNA序列,用干扰效率较高的shRNA序列转染到鸭胚成纤维细胞中抑制cofilin2基因的表达,再检测cofilin2在DEV复制过程中表达情况。结果显示:4对shRNA干扰质粒经转染至鸭胚成纤维细胞后,经荧光显微镜观察,构建的4对shRNA干扰质粒均成功转染并得到表达;4对干扰质粒沉默率分别为4.96%±0.78%、41.12%±2.94%、17.55%±2.07%、54.02%±1.73%,以cofilin2-86的沉默效率最高;cofilin2-86转染到鸭胚成纤维细胞,经DEV感染不同时间,其DEV核酸表达量明显下降。综上所述,靶向cofilin2基因RNA干扰在DEV复制和增殖过程发挥重要作用。

一例种鸭病毒性肠炎与圆环病毒混合感染的实验室诊断

鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE)又称鸭瘟,是雁形目鸭科成员的一种急性、接触性、败血性传染病,主要侵害宿主的消化道、内脏和淋巴器官,造成消化道出血、淋巴器官受损和实质性器官的退行性病变。该病呈世界分布,在我国主要养鸭地区广泛存在,但主要呈地方性流行。该病的病原是鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV),现归于疱疹病毒科马立克氏病毒属。该病毒可以感染各品种和日龄的鸭,发病率和死亡率最高可达100%,是对鸭致病性最强的病原之一,一旦感染往往会对鸭群造成严重损失。黄引贤等[1]最早于1959年报道了该病在我国的存在,之后我国研发出了针对该病的弱毒疫苗,起到了较好的防控效果。