鸭胚成纤维细胞中鸭瘟强毒的增殖特性研究

通过细胞培养物光学显微观察、细胞超薄切片研究、定量PCR检测技术对鸭胚成纤维细胞中鸭瘟强毒的增殖特性进行了研究。结果表明:鸭瘟强毒接种鸭胚成纤维细胞后42h,可使细胞培养物出现大量明显的蚀斑病变。细胞培养物的超薄切片电镜观察研究表明,病毒核酸在胞核内常集中分布,呈直径35～45nm的圆形颗粒状;核衣壳在胞核和胞浆内都有分布,呈直径90～100nm的圆形颗粒状;成熟病毒位于胞浆空泡内,呈直径150～300nm的圆形,有囊膜和皮层结构;病毒通过囊膜与胞膜融合入侵细胞,在核内生成核酸、装配核衣壳,在胞浆中得到皮层,出芽到胞浆空泡内获得囊膜,通过胞吐作用释放到胞外。定量PCR研究表明:鸭瘟强毒接种细胞后10h开始明显复制,接毒后30h时含量趋于稳定,接毒后22h时开始向胞外释放,50h时达最大值,细胞和上清中病毒含量的增幅均为103左右,病毒主要存在于细胞中,其含量为上清的102～103倍。

一株适应于鸡胚成纤维细胞培养的鸭瘟强毒的研究

鸭瘟(DP)是一种严重危害养鸭业的传染病。目前,对该病已经进行了细致的研究(Jansen1961,Toth,1969)。据Leibovitz(1968)报道,在1959年初的鸭瘟暴发中,死亡率达100％。近年暴发中的死亡率为60-70％(Sarker,1982)。自1964年以来。

鸭瘟病毒强毒株在感染鸭实质器官内的增殖与分布

鸭瘟病毒(DPV)CHv强毒株经皮下注射、滴鼻和口服3种途径分别感染20日龄天府肉鸭,于攻毒后10、30、60、90min以及4、12、48、72h和9、15d每组分别剖杀2只鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊、哈德氏腺等实质器官,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV在这些器官的分布和增殖进行检测。结果表明,DPV分布到具体器官的速度与感染的途径、鸭的解剖结构密切相关,其中皮下注射是DPV分布到各实质器官速度最快的途径。30min于皮下感染鸭的肝、脾、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、肺、脑、肾,口服感染鸭的肺和法氏囊,滴鼻感染鸭的心脏和哈德氏腺均检测到DPV-DNA;90min所有受检样品中检测到DPV-DNA。鸭抗DPV感染的免疫器官的重要性依次是脾、胸腺、法氏囊和哈德氏腺,30min内DPV-DNA分布到脾、胸腺、法氏囊的速度和数量决定了DPV感染的潜伏期和疾病的严重程度。不同途经感染鸭的相同器官在同一时间内的DPV-DNA拷贝数大多以皮下感染鸭为最高。DPV致死鸭的法氏囊和肾是DPV-DNA含量最高的实质器官。

原位杂交检测人工感染鸭体内鸭瘟病毒的复制

Replication of duck plague virus(DPV) in artificially infected ducks were detected by in situ hybridization(ISH)which employed a 37bp oligonucleotide as probe designed according to DPV DNA sequence in GenBank.The results indicated that DPV DNA was detected in liver,intestine and bursa Fabricius at 4 h,in spleen and esophagus at 6h,in thymus at 12h post infection;DPV DNA in lung and kidney was detected only in dead ducks and no positive signal was detected in muscle,heart,cerebrum and pancreas.DPV DNA was distributed in cell nucleus and cytoplasm.Hepatocytes,sinus endodermal cells and Kuffer’s cells were the mainly infected cell types in liver.DPV DNA was mainly detected in epithelium of villi,in lamina propria of intestinal villi of duodenum,in stratum spinosum of esophagus,and in epithelium,cortex,medulla of bursa Fabricius.The positive signals were mainly detected in medulla of thymus,lymphocytes and macrophages of spleen.The research suggests that ISH is a direct and specific method in detecting DPV DNA in paraffin sections and it’s also a good method for virus diagnosis and DNA location of DPV.

生物素标记寡核苷酸探针原位检测石蜡切片鸭瘟病毒核酸

据GenBank中有关鸭瘟病毒(DPV)的1个765 bp的EcoRⅠ片段序列,用Oligo软件设计长度为37 bp的寡核苷酸并用生物素标记制备探针,经blast分析和斑点杂交检测探针的特异性后,建立从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法并对人工感染死亡鸭的各组织器官进行检测,结果显示:(1)寡核苷酸探针能特异性检测到DPV强毒CHv株DNA,对鸭病毒性肝炎病毒QL79株RNA、血清1型鸭疫里默氏杆菌DNA、鸭源多杀性巴氏杆菌DNA、鸭沙门菌DNA和大肠杆菌DNA的检测结果为阴性。(2)以寡核苷酸探针建立的从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法的最佳反应条件为:组织切片先用0.2 mol/L HCl 37℃处理20 min,然后用100 mg/L的蛋白酶K 37℃消化15 min左右;杂交时探针工作浓度为350μg/L;Avidin-AP的工作稀释度为1∶100。(3)以所建立的原位杂交法检测DPV-CHv强毒人工感染死亡鸭的各组织器官,结果肝脏、肠道、法氏囊、脾脏、食道、肺脏和肾脏呈阳性反应,DPV的DNA分布于特定细胞的细胞浆和细胞核。结果表明,原位杂交检测石蜡切片中DPV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DPV进行检测和病原定位的良好方法,可用于DPV的侵染过程和致病机理研究及回顾性诊断检测。