雏鸭人工接种鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY后组织结构动态变化的比较研究

对鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭后的组织变化进行了动态观察比较研究。结果显示:雏鸭接毒12 h肝、肾呈现轻度细胞变性;48 h后组织变性程度减轻,汇管区周围细胞增生;144 h细胞核、浆染色加深,组织修复迹象明显;14 d结构正常。接毒12 h脾脏白髓、法氏囊滤泡中淋巴细胞减少,72 h脾、24 h法氏囊中淋巴细胞有所增多。心脏、肺、脑组织在接毒各期皆有轻度的充血、出血。鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY与标准毒导致的多组织变性、坏死相比,其变性轻而可逆;与疫苗HY所致的组织变化相似,但结构恢复时间早。结果表明:鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭,虽可造成雏鸭肝、肾等实质器官轻微的组织病变,但损伤的组织结构可在短期内修复,并恢复至正常;脾脏、法氏囊中的淋巴细胞在接毒后,也由减少到增多。本研究为鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY用作鸭肝炎疫苗株的安全性从病理组织学角度提供了依据。

雏鸭接种Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株后血清生化指标的动态变化

用Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株人工接种4日龄雏鸭，于接种后第6、12、24、48、72、96、144、168、192h及14d采集接种鸭的血液，分离血清，进行生化指标测定，并与同期接种的弱毒疫苗HY、标准毒及对照组的血清生化指标进行比对。与对照组比较：MY组和HY组的白蛋白在接种后24h明显降低，48h差异极显著；血清谷丙转氨酶于24h、144h时段明显升高，且MY组持续至192h。标毒组则表现为接毒后，血清葡萄糖于24～96h降低，甘油三酯于72h、192h显著升高；血清总蛋白72h、96h、144h，白蛋白24—144h，球蛋白72～96h，144h明显降低；谷丙转氨酶于24～192h，血清谷草转氨酶在24～72h显著升高；尿酸72h呈一过性升高。结果表明，感染Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株与弱毒疫苗HY的血清生化变化规律相似。

1株基因3型鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒株的培育

为研发基因3型鸭甲肝病毒(Duckhepatitis virustype3,DHAV-3)的弱毒活疫苗,用SPF鸡胚对DHAV-3Y株进行了连续传代致弱,由此获得第80代鸡胚适应毒。致病性试验结果显示,第80代毒株对1日龄雏鸭已无致病性。免疫攻毒保护试验显示,雏鸭在1日龄时经肌肉注射途径免疫第80代鸡胚适应毒,能有效抵抗7日龄时的强毒感染,保护指数为100%。表明第80代鸡胚适应毒是一株具有良好免疫原性的鸡胚化弱毒疫苗候选株。

鸭瘟鸡胚化弱毒株细菌人工染色体的构建与鉴定

为了构建鸭瘟鸡胚化弱毒株DEV(atten)的细菌人工染色体(BAC),将转移载体质粒pDEVgC-pHA2DNA和DEV(atten)DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行重组,通过三轮挑斑纯化,以获得纯化的鸭瘟重组病毒。将纯化的鸭瘟重组病毒的DNA电转化到E.Coli DH10B中,对获得的克隆用酶切、PCR方法进行鉴定并测序。提取阳性克隆的DNA转染CEF,以拯救重组病毒。再通过将带有相同同源臂和UL44(糖蛋白质C,gC)基因的片段和阳性克隆的DNA共转染鸡胚成纤维细胞进行重组,以获得gC恢复病毒。采用0.01感染复数(MOI)感染CEF对亲本病毒、恢复病毒进行多步法生长曲线测定,比较其有无差异。结果显示:成功获得了DEV的mini-F重组病毒,命名为DEV(atten)-mini-F,获得2个阳性克隆S1、S2,将S1命名为pDEV(atten),应用pDEV(atten)拯救重组病毒获得gC恢复病毒DEV(atten)ΔgC-R,生长特性的结果显示亲本病毒与恢复病毒间无显著性差异。表明成功构建的DEV(atten)的细菌人工染色体为全基因组的感染性克隆。

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Vp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果。结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用。首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力。

鸭肝炎病毒A66弱毒株在鸡胚成纤维细胞上的培养：张小飞

将鸡胚致弱的鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）Ａ６６侏接种于鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）进行细胞培养，通过对细胞培养物进行病毒滴度测定、鸡胚中和试验和电镜检查，证明了ＤＨＶＡ６６毒株能够在ＣＥＦ上增殖。试验还表明，犊牛血清对ＤＨＶ增殖具有明显的抑制作用。此外，还根据细胞培养物病毒滴度毒滴度测定结果绘制出了病毒在ＣＥＦ上的生长曲线。

一株鸭肝炎弱毒在鸭胚肾单层细胞上增殖特性的研究

本文介绍８个鸭肝炎毒株在鸭胚肾细胞上连续传５代的情况，发现其中一弱毒株Ｅ２８从第一代即产生了明显的细胞病变，在传代过程中细胞病变稳定地出现。本文还用起薄切片技术、免疫荧光试验和细胞培养物提纯病毒的电镜观察。

优化鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗(CH60株)的生产工艺参数

鸭肝炎病毒属于小核糖核酸病毒,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个血清型。目前,我国只发现鸭病毒性肝炎病毒I型。鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗(CH60株)可用于预防I型鸭肝炎。根据制苗用毒液的制备工艺环节中,不同的鸡胚接种日龄、毒种不同的稀释倍数对鸡胚死亡的高峰时间、每胚的平均收获单产结果都不同。目前存在鸡胚的死亡时间靠前,收率低等问题,为了得到更稳定的产品质量,还需要进一步优化疫苗的生产工艺参数。

鸭病毒性肝炎活疫苗（CH60株）规模化生产工艺改进试验

在鸭病毒性肝炎活疫苗（CH60株）生产时，用10日龄和11日龄进行病毒增值，同时把病毒稀释倍数由100倍改为5000倍，将鸡胚死亡高峰期、最终死亡率、单胚平均收获单产、病毒含量ELD50进行对比分析，结果表明将病毒进行100倍稀释后，用11日龄鸡胚增值鸭病毒性肝炎目日毒（CH60株）与10日龄鸡胚相比死亡高峰期时间、最终死亡率、病毒含量ELD50、单胚平均收获单产等基本相同；将病毒进行5000倍稀释后，用11日龄鸡胚增值鸭病毒性肝炎弱毒（CH60株）与10日龄鸡胚相比死亡高峰期时间推迟12～24h，最终死亡率基本相同、单胚平均收获单产可提高30％左右、病毒含量ELD50略有上升；采用5000倍稀释病毒，接种l1日龄鸡胚的生产工艺可以提高收获单产，降低生产成本，提高产品效价。

DHAV-3适应鸡胚毒株的培育及特性测定

旨在培育鸭甲型肝炎病毒血清3型(DHAV-3)适应鸡胚毒株并对其特性进行研究。利用鸭胚从临床病料中分离得到的DHAV-3 LC强毒株经卵黄囊接种鸡胚传代、纯化获得适应鸡胚毒株,并对毒株的致病性、毒力稳定性、免疫原性和基因组特征进行测定。结果显示,利用鸭胚接种成功从病料中分离鉴定DHAV-3 LC强毒株,对鸭胚和雏鸭的半数致死量分别为10-6.20/0.2 mL和10^(-4.25)/0.2 mL。经卵黄囊接种鸡胚69代,获得适应鸡胚毒株DHAV-3 CA。CA株的F4、F16、F21、F31、F41和F51代病毒液的ELD50分别为10^(-6.44)/0.3 mL,10^(-6.60)/0.3 mL,10^(-7.44)/0.3 mL,10^(-7.80)/0.3 mL,10-7.43/0.3 mL和10^(7.25)/0.3 mL;各代病毒对1日龄雏鸭不致病,但在体内连续传代出现接种雏鸭死亡。F21代病毒制备的油包水灭活疫苗免疫蛋鸡,血清中和抗体效价达1∶500以上;以2.5×10^(4.8)ELD50及以上剂量的F31代病毒经颈部皮下接种1日龄雏鸭,攻毒保护率均在90%以上。F21代病毒全基因组序列分析显示,与DHAV-3 LC相比,基因组内无碱基插入或缺失,但有32个位点发生碱基突变;VP0基因的C1410T和A1411G突变与病毒在鸡胚中的传代次数有相关性。本试验成功培育出适应鸡胚毒株DHAV-3 CA,具有良好的免疫原性,但存在致病性返祖现象。

蛋鸭常用疫苗的选择和使用

1 雏鸭肝炎弱毒疫苗 用于预防雏鸭肝炎，采用雏鸭肝炎鸡胚化或鸭胚化弱毒株，接种12～14日龄鸭胚尿囊腔或9～10日龄鸡胚尿囊腔，收获48～96h内死亡胚的尿囊液，