珠子草等对原代鸭肝细胞的延长生长作用

我们在原代鸭肝细胞培养中，观察到珠子草及其亚种等提取物可以延长肝细胞生长，从而抑制纤维母细胞增生。

原代鸭肝细胞的原位灌流分离法

目的：探索优化的原代鸭肝细胞分离方法，为鸭肝细胞在体外研究中的应用奠定基础。方法：分别采用胶原酶（Ⅰ型与Ⅳ型）经门静脉或胆总管原位灌流分离鸭肝细胞，观测肝细胞产量、存活率及其形态。结果：１．经门静脉原位灌流分离鸭肝细胞效果明显优于经胆总管灌流法；２．以右心室为灌流液流出道分离鸭肝细胞效果明显优于经下腔静脉流出道分离法：３．Ⅰ型胶原魂与Ⅳ型胶原酶灌流分离鸭肝细胞效果相当。结论：采用Ⅰ型或Ⅳ型胶原酶经门静脉－右心室原位灌流分离鸭肝细胞为一较好的方法，有利于鸭肝细胞为模型的体外研究工作的开展。

鸭肝细胞原代培养方法的建立

鸭肝细胞原代培养方法的建立微生物学教研室李秋香，李冬田，苏琦华，任中原乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的感染是世界嘱目的社会卫生问题。多年来，人们一直试图通过组织培养系统建立ＨＢＶ的研究模型。由于鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）与人ＨＢＶ一分相似，因此国内外学者一致...

HBV DNA转染原代鸭肝细胞初步观察

目的 通过观测人ＨＢＶ ＤＮＡ在非哺乳动物──鸭肝细胞中的复制和表达水平，探讨人ＨＢＶ感染与复制的跨种属特异性，为建立人ＨＢＶ ＤＮＡ转染跨种属肝细胞模型奠定基础。方法 获取线性ＨＢＶ ＤＮＡ并电转染原代鸭肝细胞，电转后４８ｈ采用ＩＭＸ系统检测鸭肝细胞中ＨＢｓＡｇ和 ＨＢｅＡｇ表达水平，用 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ－ｔｉｎｇ和ｄｏｔ ｂ１ｏｔｔｉｎｇ检测ＨＢＶ ＤＮＡ复制情况。以单纯电击肝细胞为对照。结果 转染组原代鸭肝细胞裂解液中ＨＢｓＡｇ为９．１０（Ｐ／Ｎ值≥ ２．１为阳性），ＨＢｅＡｇ为阴性；上清液中二者均为阴性。转染组原代鸭肝细胞裂解液ｄｏｔｂｌｏｔｔｉｎｇ呈强阳性；转染组肝细胞总 ＤＮＡ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ显示约４．０ ｋｂ以下分子涂抹带，为游离复制型 ＨＢＶＤＮＡ，包括 ｒｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ与 ｓｓＤＮＡ等复制中间体；未见整合型 ＨＢＶ ＤＮＡ──高分子区（４．０－２４．０ ｋｂ）涂抹带。对照组上述指标均为阴性。结论 人ＨＢＶ ＤＮＡ能在原代鸭肝细胞中复制和表达，可能为肝细胞内环境依赖性，无严格种属特异性限制。

氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒(DHBV)作用的研究

通过建立鸭原代肝细胞-DHBV感染模型研究氧化苦参碱抗DHBV的作用。分别在DHBV感染前、感染同时以及感染后给药，利用打点杂交、Southern印迹核酸杂交和荧光定量PCR方法分别检测培养细胞上清及细胞内病毒核酸，观察氧化苦参碱在病毒感染的各个环节所起的抗病毒作用。实验结果显示：1mg／mL氧化苦参碱处理细胞后，鸭原代肝细胞培养上清及细胞内的DHBV核酸明显低于病毒感染对照组，病毒抑制率达91．6％；在病毒感染同时加药对病毒的抑制率可达98．5％；感染后持续用药能使不同培养天数的鸭肝细胞内的DHBV核酸降低60．5％～96．6％；氧化苦参碱与DHBV共孵育后，可以使病毒感染力下降69．6％。结果说明氧化苦参碱可以在DHBV感染鸭原代肝细胞的多个环节，包括病毒吸附、进入细胞及细胞内复制等方面发挥抗病毒作用。

鸭疫里默氏杆菌对鸭胚肝细胞粘附入侵能力的研究

为了分析鸭胚肝细胞用于鸭疫里默氏杆菌粘附入侵实验的可行性,本研究比较了鸭疫里默氏杆菌对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附和入侵能力。首先将构建的互补质粒pRES1-ompA通过双亲本接合转导的方法导入ompA基因缺失株Th4ΔompA中,构建得到缺失株的回复菌株cTh4ΔompA;然后比较了野生株Th4、缺失株Th4ΔompA及回复株cTh4ΔompA菌株对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附入侵能力。结果表明,与野生株Th4菌株相比,缺失株Th4ΔompA对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附能力分别降低了3.32倍和3.12倍,入侵能力分别降低了2.25倍和7.58倍,而cTh4ΔompA对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附入侵能力均得到部分回复。本研究结果表明鸭胚肝细胞可用于鸭疫里默氏杆菌粘附入侵能力的分析。

鸭乙型肝炎病毒在鸭肝原代细胞中复制的试验观察

取正常雏鸭肝脏制备原代细胞，在细胞培养板中进行鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）感染，通过ＰＣＲ、紫外分光光度仪、细胞原位杂交等实验技术的检测，观察ＤＨＢＶ在鸭肝原代细胞中的复制。结果，ＤＨＢＶ感染鸭肝原代细胞后３ｄ，病毒即表现出明显的复制现象，在随后一周内细胞内ＤＨＢＶ复制逐渐增强；第二周病毒复制能力开始逐渐衰减，３５ｄ后复制能力基本消失。病毒分布和复制区域主要在肝细胞核内。

荧光定量PCR观察鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的动态变化

通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)观察后天感染和先天感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量的动态变化,探讨适宜于抗HBV药物的体外实验、HBV生物学特性及乙型肝炎发病机制研究的鸭胚肝细胞模型。筛选先天感染DHBV的阳性鸭胚并进行肝细胞原代培养,对DHBV阴性鸭胚肝细胞原代培养,并以不同浓度的DHBV强阳性血清感染细胞。于细胞接种后不同时间点收集培养上清,FQ-PCR检测分析培养上清DHBV DNA的含量。结果显示:先天感染的鸭胚肝细胞接种第2 d上清中DHBV载量最高,第3 d大幅下降,然后缓慢上升,第8 d达到高峰,至第15 d时仍然与高峰时接近,DHBV载量的数量级都在108cop ies/mL没有变化;后天感染不同浓度的DHBV阳性血清的鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV载量动态变化趋势基本一致,DHBV感染后第3 d大幅下降,以后逐渐上升,至第11 d达高峰,第15 d又略有下降。结论:先天感染DHBV的鸭胚肝细胞的培养上清病毒载量上升至峰值时间短,病毒载量稳定,更适合于抗HBV药物的体外实验研究。

基于鸭胚原代肝细胞的抗乙肝病毒药物评价模型的建立

[目的]建立基于鸭胚原代肝细胞的抗乙肝药物筛选及评价模型。[方法]采用PCR技术鉴定鸭乙肝病毒(DHBV)感染鸭胚,分离感染鸭胚肝细胞原代培养,运用建立的荧光定量PCR技术检测鸭胚肝细胞DHBV-DNA复制水平,从而建立基于鸭胚原代肝细胞的抗乙肝药物评价模型。[结果]选择18～22日龄鸭胚建立了优化的鸭胚肝细胞原代培养方法和鸭胚肝细胞中DHBV-DNA水平的荧光定量PCR检测技术。[结论]该研究建立了基于鸭胚肝细胞的抗乙肝药物评价模型,经实践证实该模型具有特异、灵敏、重复性好和操作简便的优点,适用于抗乙肝化合物的筛选与评价。

芒果苷抗DHAV-1致鸭胚肝细胞炎性损伤的研究

【目的】探究芒果苷(mangiferin,Man)对鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus-1,DHAV-1)致鸭胚肝细胞(DEHCs)炎性损伤的影响。【方法】从14日龄SPF级麻鸭鸭胚肝脏组织分离原代DEHCs,用含不同浓度芒果苷(0、5、10、20、40、80和160μmol/L)的培养液培养48 h后,通过CCK-8法检测其安全浓度范围;用安全浓度的芒果苷培养DEHCs 12、24和48 h后,检测培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活力,判定芒果苷对DEHCs的毒性作用。将DEHCs分为对照组(Mock)、模型组(Model)、芒果苷组(Man10、Man20和Man40)和利巴韦林组(Rib),每组3个重复,所有组细胞血清饥饿培养12 h后,Mock组加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基,Model、Man10、Man20、Man40和Rib组用DHAV-1(MOI=1.0)攻毒2 h后,Model组更换为含10%FBS的DMEM培养基,Man10、Man20、Man40培养基中分别添加10、20和40μmol/L芒果苷,Rib组添加1μmol/L利巴韦林。48 h后收集各组细胞,用比色法检测丙二醛(MDA)含量及过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、总一氧化氮合酶(T-NOS)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性;免疫荧光(IF)法检测DHAV-1在各组DEHCs中的分布情况;Western blotting法检测NLRP3/Pro-Caspase1/IL-1β通路蛋白的表达情况。提取2日龄SPF麻鸭的新鲜全血,分离鸭外周血单个核细胞(duPBMCs),duPBMCs分组及处理同DEHCs,ELISA法检测各组duPBMCs上清液中白介素8(IL-8)和IL-1β的含量。【结果】与0μmol/L芒果苷组相比,80和160μmol/L芒果苷组细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),因此5~40μmol/L芒果苷为处理DEHCs的安全给药浓度。20和40μmol/L芒果苷处理48 h细胞上清液中LDH活力显著低于处理12和24 h(P<0.05),20和40μmol/L芒果苷处理12和24 h细胞上清液中LDH活力显著高于5和10μmol/L芒果苷处理(P<0.05),各浓度芒果苷处理48 h细胞上清液中LDH活力均差异不显著(P>0.05),故48 h为最适处理时间。与Mock组相比,Model组DEHCs中CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活性均显著降低(P<0.05),DEHCs中MDA含量、T-NOS活性、DHAV-1拷贝数、DHAV-1阳性率、NLRP3表达量及duPBMCs中IL-8、IL-1β分泌量均显著升高(P<0.05)。与Model组相比,Man10、Man20和Man40组DEHCs中CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活性均显著提高(P<0.05),DEHCs中MDA含量、T-NOS活性、DHAV-1拷贝数、DHAV-1阳性率、NLRP3表达量及duPBMCs中IL-8、IL-1β分泌量均显著降低(P<0.05)。【结论】芒果苷可通过增加抗氧化能力、降低DHAV-1的复制水平、抑制NLRP3通路的激活、降低促炎细胞因子的释放抗DHAV-1感染DEHCs造成的炎性损伤。

蛋氨酸对HepG2细胞和鸭原代肝细胞生长和脂质代谢的影响

本研究旨在研究蛋氨酸(Met)对HepG2细胞和鸭原代肝细胞生长及脂质代谢的影响。设置2个体外肝细胞试验,分别以HepG2细胞和鸭原代肝细胞为研究对象,研究不同浓度Met培养基对HepG2细胞和鸭原代肝细胞的存活率、脂质沉积及其相关基因和蛋白表达的影响。结果表明:1)培养基中Met浓度为0μmol/L时HepG2细胞存活率显著低于其他Met浓度(P<0.05),培养基中Met浓度为0、6.25、12.5和25μmol/L时鸭原代肝细胞存活率显著低于显著100和200μmol/L时(P<0.05),随着培养基Met浓度增加,25μmol/L Met时HepG2细胞存活率达到平台,100μmol/L Met时鸭原代肝细胞存活率达到平台。2)与200μmol/L Met组相比,0、25μmol/L Met组脂滴数量明显增加,单位细胞数目油红O的吸光度显著增加(P<0.05),且0、25μmol/L组之间无显著差异(P>0.05)。3)与200μmol/L Met组相比,0、25μmol/L Met组HepG2细胞中链酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)、二氢硫辛酸脱氢酶(DLD)和泛醌还原型酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶Fe-S蛋白1(NDUFS1)基因表达量显著下调(P<0.05),且0μmol/L Met组NDUFS1蛋白表达量显著下调(P<0.05)。4)与200μmol/L Met组相比,0、25、100μmol/L Met组鸭原代肝细胞中苹果酸脱氢酶(MDH)1、MDH2、DLD、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶2(HMGCS2)、电子转移黄素蛋白α亚基(ETFA)、电子传递黄素蛋白脱氢酶(ETFED)和NDUFS1基因表达量显著下调(P<0.05),且0、25μmol/L Met组NDUFS1蛋白表达量显著下调(P<0.05)。综上所述,Met缺乏可导致HepG2细胞和鸭原代肝细胞生长受阻和脂质沉积增加,主要由于肝细胞中脂肪酸β-氧化、三羧酸循环、呼吸链电子传递和酮体生成等过程受阻,导致肝细胞能量供应不足。

应用鸭胚肝细胞培养鸭肿头败血症病毒XD株的研究

用DMEM培养基加小牛血清培养鸭胚肝细胞,结果显示,细胞贴壁良好,72h细胞即长满瓶底,形成致密的单层细胞。将在鸭胚尿囊腔内适应了的鸭肿头败血症病毒XD株接种鸭胚肝细胞,8h后出现以细胞界限清晰、胞核肿胀、胞内颗粒增多、细胞脱落为特征的细胞病变。将细胞毒回归鸭胚尿囊腔,成典型败血症症状。

鸭γ干扰素体外抑制鸭乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 在体外模型中系统研究DuIFN γ对鸭乙型肝炎病毒 (DHBV)复制的影响 ,探讨其抑制病毒复制的可能机制。方法 用重组DuIFN γ及DHBV特异抗原刺激的PBMC上清液 ,分别作用于DHBV慢性感染的原代鸭肝细胞 (PDH) ,检测PDH上清液中DHBVDNA、DHBsAg浓度和胞内病毒复制水平。结果 1U mL、1 0U mL重组DuIFN γ可以抑制培养细胞上清液中DHBVDNA和DHBsAg的分泌 ,与慢性感染对照组比较 ,P <0 .0 5。病毒复制的抑制水平 (包括细胞内DHBV总DNA、闭合环状DNA以及上清液中病毒颗粒和DHBsAg)与DuIFN γ作用呈时间、剂量依赖性 ,但DHBV特异抗原刺激的PBMC上清液无明显抑制病毒复制的作用。结论 DuIFN

鸭胚肝细胞培养的研究

取１５日龄左右的鸭胚肝脏，经清洗、剪碎后，加入最终浓度为０．１２５％的胰酶，３７℃消化１５～２０分钟，以含犊牛血清的１９９培养基为营养液，置含５％ＣＯ＿２培养箱内培养７２小时，可制成鸭胚肝细胞单层培养物，若向培养基中加入１０％的鸭胚尿囊液，能促进细胞的生长，接种鸭肝炎病毒后，感染细胞可在４８小时出现ＣＰＥ，９６小时形成空斑。

鸭ChREBP基因表达载体构建及其对原代肝细胞和PC3细胞脂质性状的影响

【目的】探究鸭原代肝细胞脂质含量与碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达的关联性,为深入研究ChREBP基因对畜禽脂质代谢的遗传调控机制提供参考依据。【方法】采用Ⅳ型胶原酶消化法分离孵化21 d的鸭胚原代肝细胞,以DMEM高糖培养基进行培养。利用RT-PCR扩增鸭ChREBP基因编码区(CDS)序列,构建携带His标签的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His,通过脂质体法分别转染鸭胚原代肝细胞和人前列腺癌细胞(PC3);采用His标签检测试剂盒检测ChREBP基因的表达量,以脂质指标测定试剂盒测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量,并分析鸭胚原代肝细胞和PC3细胞中ChREBP基因表达与脂质指标含量的相关性。【结果】以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞均能发出绿色荧光,表明携带His标签的ChREBP基因能在鸭原代肝细胞和PC3细胞中表达。ChREBP基因表达量与鸭原代肝细胞和PC3细胞中的TG、TC和HDL含量均呈极显著正相关(P<0.01,下同),与LDL含量呈极显著负相关。【结论】以构建的真核表达载体pEGFP-N3-ChREBP-His转染鸭原代肝细胞和PC3细胞后均能发出绿色荧光,说明ChREBP基因表达对鸭原代肝细胞和PC3细胞中的脂质代谢作用机理相似,可促进细胞脂质累积。

新型鸭肝炎病毒疫苗候选株的筛选

本试验对临床患病鸭分离的一株疑似鸭肝炎病毒进行了血清型鉴定和毒力测定。利用Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒鉴别引物对提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增;将分离病毒分别与Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒阳性血清进行中和试验;根据测定的病毒ELD50,进行雏鸭攻毒和鸭胚肝细胞接毒试验。结果表明:RT-PCR扩增出了与新型鸭肝炎病毒预期片段相符的705bp条带;分离病毒不能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清中和,新型鸭肝炎病毒阳性血清对该病毒的中和效价是1:200,说明该分离株属于新型鸭肝炎病毒。该毒株的ELD50为10-5.7/0.2mL,能引起攻毒鸭与临床病例一致的症状和病变以及显著的肝细胞病变,可作为新型鸭肝炎病毒的疫苗候选株开发应用。

体外抗乙肝病毒研究进展

自1986年Sureau[1]等首先报道筛选出能表达乙型肝炎病毒(HBV)全部病毒标志的细胞株后,HBV体外培养取得突破.在众多培养系统中,HepG 2.2.15细胞株应用最多,也有以PLC/PRF/5细胞株模型和肝细胞原代培养作为研究工具.

基因C型鸭甲型肝炎病毒在鸭胚原代肝细胞中的增殖规律

为建立基因C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-C)在鸭胚原代肝细胞(DELC)上的感染模型,利用17日龄鸭胚制备了DELC,接种DHAV-C,观察接毒后DELC的病变情况,并采用荧光定量PCR方法对病毒含量进行测定,绘制病毒增殖曲线。结果显示,DELC在接毒后第36小时开始出现细胞病变,第60小时细胞病变最为明显,表现为细胞间隙增大、拉网成丝状、细胞脱落。DHAV-C感染DELC后第12、24、36、48、60、72、84、96小时的病毒量分别为1.23×108、2.14×108、2.95×108、4.37×108、5.75×108、1.70×108、9.55×107和6.46×107 copies/μL。结果表明,本研究成功建立了DHAV-C在DELC上的感染模型,为进一步研究DHAV-C的致病机理、病毒与细胞的相互作用以及建立免疫学诊断方法奠定了基础。

适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。

拉米夫定联合原儿茶酸对鸭乙肝病毒的体外抑制

目的:研究原儿茶酸(PA)、拉米夫定(3TC)单用以及联合对鸭HBV(DHBV)感染、复制不同时期的影响。方法:利用感染DHBV的鸭原代肝细胞模型,从病毒感染的不同时期研究PA、3TC单用及合用的抗病毒效果。结果:PA、3TC单用及其合用,分别于DHBV感染前,感染的同时及感染后给药,均可有效抑制DHBV对鸭原代肝细胞的感染。虽然PA与3TC合用对DHBV的预防与阻断作用与单用3TC相比没有显著差异,但对DHBV的吸附与进入,感染活性与复制能力,以及肝细胞中AST,ALT酶活的抑制能力均显著强于单用3TC组。结论:PA与3TC药物组合不仅有比二者单用更强的抗DHBV作用,而且对DHBV所致鸭原代肝细胞损伤也有更强的保护作用。