鸭腺病毒B血清1型和血清2型双重PCR检测方法的建立及应用

番鸭白肝病是2014年以来我国番鸭流行的一种新疫病,其病原为一种与鸭腺病毒B型法国GR株同源性较高的新型腺病毒,暂命名为鸭腺病毒B血清2型(DAdV-B2),将法国GR株命名为鸭腺病毒B血清1型(DAdV-B1)。为建立同时检测DAdV-B1和DAdV-B2的方法,本研究根据GenBank中DAdV-B1 fiber基因和DAdV-B2 fiber1基因序列特征,分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可以同时检测这两种病毒的双重PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为60.1℃,最适引物浓度为0.16μmol/L;利用该方法对DAdV-B1、DAdV-B2、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、禽腺病毒血清4型(FAdV-4)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、新型呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭源鹅细小病毒(MDGPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和禽坦布苏病毒(ATUMV)等检测,结果显示,该方法仅对DAdV-B1和DAdV-B2有特异性扩增,对其他鸭临床常见病原均无扩增,特异性较强。将DAdV-B1 fiber和DAdV-B2 fiber1质粒标准品等体积混合并作10倍倍比稀释后作为模板,利用该双重PCR方法检测,结果显示,该方法对DAdV-B1 fiber和DAdV-B2 fiber1质粒标准品的最低检测限分别为175拷贝/μL和163拷贝/μL,对DAdV-B2的最低检出滴度为1×10^(1) TCID_(50),敏感性较高。批内和批间的重复性试验检测结果均一致,重复性好。利用该双重PCR与单一PCR方法同时对64份临床样品检测,结果显示二者的符合率为100%,其中DAdV-B2的阳性率为79.7%(51/64),DAdV-B1的阳性率为4.7%(3/64)。以上结果表明本研究建立的双重PCR方法特异性较强、敏感性较高和稳定性较好,为DAdV-B1和DAdV-B2的临床鉴别检测及其分子流行病学调查提供了技术手段。

禽腺病毒QU分离株的致病性及细胞适应性研究

QU分离株是一株类似产蛋下降综合征病毒,属于鸭腺病毒1型病毒。通过人工感染和细胞增殖试验,结果显示QU分离株接种无特定病原雏鸡未出现临床病症及生长发育障碍,不致死鸡胚,对鸭胚的致死率明显比引起产蛋下降的HS株低。QU株在鸡胚肝细胞、鸭胚成纤维细胞及鸡胚成纤维细胞上生长良好,产生典型细胞病变,且在鸡胚肝细胞上的增殖滴度最高,但不适应鸡胚肾细胞。这些数据说明QU株系对鸡具有低毒力的腺病毒,有可能用作禽用基因疫苗或基因治疗的候选病毒载体。

不同宿主源禽腺病毒分离株对雏鸡的致病性比较

鸭腺病毒1型病毒可作为优良的重组疫苗载体。为了筛选低毒力的鸭腺病毒1型病毒毒株,分别用病毒QU株和HS株对20日龄SPF鸡进行攻毒,4d后检测其血清生化指标的变化情况并与对照组进行比较,同时取其肝脏进行病理组织学观察。发现QU组的各项生化指标均没有明显变化,肝组织形态与对照组相同;HS组的谷草转氨酶、碱性磷酸酶、胆碱脂酶和血淀粉酶显著降低,总蛋白、白蛋白和球蛋白极显著降低,并且肝细胞大量坏死。结果表明,HS株病毒主要引起鸡肝脏和胰腺的损伤,具有较强的致病性;QU株病毒对雏鸡的生理状况几乎没有影响,毒力很弱,适合作为重组疫苗载体。