应用宏基因组学鉴定国内第一株鸭2型腺病毒

为分离鉴定广东某养鸭场疑似"肝坏死"病例的病原,本研究将采集的病料样品感染番鸭胚及番鸭胚成纤维细胞(MDEF)进行病原分离,提取出现细胞病变培养物的核酸,采用宏基因组学方法,以随机引物反转录并合成双链DNA进行PCR扩增,扩增产物进行分子克隆和测序分析。结果显示:F6代分离的病毒滴度为log10^(5.0)TCID_(50)/m L,能够导致9日龄~11日龄番鸭胚死亡及MDEF产生明显细胞病变。50个随机克隆经Gen Bank检索有28个为鸭2型腺病毒(DAd V-2)同源序列,核苷酸同源性为92%~99%。28个同源序列形成8个毗连序列群,共计15 107 bp,覆盖DAd V-2基因组全长的34.54%,分离株与Gen Bank中唯一的DAd V-2 GR分离株亲缘关系最近,其部分hexon基因编码的氨基酸同源性为83.3%。参照测定序列设计的引物能够特异性扩增病毒基因。本研究首次应用宏基因组学分离获得国内首株DAd V-2,也是迄今除了法国以外国内首次报道的DAd V-2分离株。

鸭2型腺病毒的分离鉴定及hexon基因的序列分析

为了鉴定广东惠州某鸭场疑似鸭肝病患病鸭的病原,通过接种11日龄番鸭胚,从发病鸭群病料中分离出1株未知病毒,经PCR鉴定为鸭2型腺病毒。选取第6代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变、动物回归试验以及六邻体(hexon)基因序列分析。结果表明:接种病毒后第36~72小时,鸭胚集中出现死亡,胚体全身弥漫性出血,ELD_(50)为1×10^(6.31)/m L;分离的病毒不凝集鸡、鸭红细胞,在鸭胚成纤维细胞上可致细胞变圆、折光性增强等病变。将0.1 m L病毒液经肌肉接种1日龄泥鸭,主要引起雏鸭肝、脾出血和肿大。分离株hexon基因与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株(登录号:KR135164.1)和GR株(登录号:NC_024486.1)的核苷酸同源性分别为100%和76.6%。本试验为深入研究鸭2型腺病毒的致病机制及综合防控提供了重要的基础数据。

鸭腺病毒B血清1型和血清2型双重PCR检测方法的建立及应用

番鸭白肝病是2014年以来我国番鸭流行的一种新疫病,其病原为一种与鸭腺病毒B型法国GR株同源性较高的新型腺病毒,暂命名为鸭腺病毒B血清2型(DAdV-B2),将法国GR株命名为鸭腺病毒B血清1型(DAdV-B1)。为建立同时检测DAdV-B1和DAdV-B2的方法,本研究根据GenBank中DAdV-B1 fiber基因和DAdV-B2 fiber1基因序列特征,分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可以同时检测这两种病毒的双重PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为60.1℃,最适引物浓度为0.16μmol/L;利用该方法对DAdV-B1、DAdV-B2、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、禽腺病毒血清4型(FAdV-4)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、新型呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭源鹅细小病毒(MDGPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和禽坦布苏病毒(ATUMV)等检测,结果显示,该方法仅对DAdV-B1和DAdV-B2有特异性扩增,对其他鸭临床常见病原均无扩增,特异性较强。将DAdV-B1 fiber和DAdV-B2 fiber1质粒标准品等体积混合并作10倍倍比稀释后作为模板,利用该双重PCR方法检测,结果显示,该方法对DAdV-B1 fiber和DAdV-B2 fiber1质粒标准品的最低检测限分别为175拷贝/μL和163拷贝/μL,对DAdV-B2的最低检出滴度为1×10^(1) TCID_(50),敏感性较高。批内和批间的重复性试验检测结果均一致,重复性好。利用该双重PCR与单一PCR方法同时对64份临床样品检测,结果显示二者的符合率为100%,其中DAdV-B2的阳性率为79.7%(51/64),DAdV-B1的阳性率为4.7%(3/64)。以上结果表明本研究建立的双重PCR方法特异性较强、敏感性较高和稳定性较好,为DAdV-B1和DAdV-B2的临床鉴别检测及其分子流行病学调查提供了技术手段。