一例番鸭3型腺病毒感染的实验室诊断和序列分析

为确诊昆明某番鸭场送检病死番鸭的致病原因,对病死番鸭进行病理剖检、细菌分离培养、PCR检测以及序列分析。结果显示,所检样品无细菌感染,鸭3型腺病毒(DAdV-3)PCR核酸检测结果为阳性,其他病原核酸检测结果均为阴性;阳性PCR产物测序,基因序列比对及进化树分析,发现该样品基因序列与DAdV-3为同一进化树分支,同源性为100%。结合病理剖检特征、PCR检测及临床症状,诊断该番鸭场为鸭3型腺病毒感染。研究结果为DAdV-3感染的防控提供了参考。

鸭3型腺病毒的分离鉴定及其fiber基因分析

为确诊引起福建某番鸭场以肝脏肿大出血为特征的病原,采用病毒分离、PCR检测、动物回归试验、电镜观察、组织病理学诊断、fiber基因序列测定与分析等方法进行研究。结果显示:所采样品盲传15代后获得病毒,PCR可以扩增出鸭3型腺病毒(DAdV-3)的特异性片段,分离病毒可引起3日龄番鸭发病死亡,死亡率为28.6%。人工感染死亡鸭的肝脏超薄切片呈现大量晶格状排列的典型禽腺病毒颗粒,肝脏的组织病理学以'包涵体肝炎'病变为特征。其fiber基因与已报道的DAdV-3毒株核苷酸同源性均为100%。以上结果证实分离的病原为DAdV-3。本试验为DAdV-3的诊断提供了科学依据。

乳胶凝集试验检测鸭3型腺病毒方法的建立及应用

为建立快速检测鸭3型腺病毒的方法,试验采用纯化的兔抗鸭3型腺病毒血清致敏聚苯乙烯乳胶,建立了乳胶凝集试验。结果显示,致敏乳胶不自凝,可于4℃保存半年。该方法特异性强,重复性好,与琼脂扩散试验的符合率为100%。对临床样品的检测,乳胶凝集试验与PCR检测方法的符合率为85.4%。试验表明,乳胶凝集试验存在一定的漏检率,但由于其简单、快速、无需昂贵仪器等特点,可用于鸭3型腺病毒病的临床快速筛查。

番鸭细小病毒和鸭3型腺病毒的分离鉴定及其全基因组序列分析

广东省湛江市某鸭场饲养的15日龄番鸭发病,病鸭主要表现张口呼吸、腹泻等症状,病死率达40%左右。为明确其病原,采集病死鸭肝脏、脾脏等组织进行PCR检测,病原分离鉴定,全基因组序列测定与分析,动物回归试验。结果显示,从该群病死鸭中同时分离到1株番鸭细小病毒(MDPV)与1株鸭3型腺病毒(DAdV-3),分别命名为MDPV GDZJ1901株和DAdV-3 GDZJ201901株。全基因组序列分析显示,MDPV GDZJ1901株基因组全长为5067 bp,G+C含量为45.69%,与MDPV分离株的同源性介于98.1%~99.51%,其中与MDPV分离株M8株的核苷酸同源性最高,为99.51%;对其进行遗传重组分析发现,GDZJ1901以经典MDPV YY株为骨架,在P9启动子和VP3区域经历重组。DAdV-3 GDZJ201901株基因组全长为43860 bp,含27个开放阅读框(ORF)。全基因组序列比对分析显示,GDZJ201901株与已报道的DAdV-3同源性最高,为99.89%~99.91%,且含有2个fiber基因,符合DAdV-3基因组特征。动物回归试验结果显示,新分离的MDPV和DAdV-3毒株对3日龄雏番鸭的致死率分别为28.6%和21.4%。结果表明,从同一群发病雏鸭中同时分离到MDPV和DAdV-3野毒株。

鸭1型圆环病毒与鸭3型腺病毒共感染的诊断

2022年2月,福建古田某番鸭养殖场饲养的番鸭自19日龄开始发病并出现死亡,根据其流行病学特点、临床症状和剖检病变,疑似为鸭3型腺病毒感染。后经实验室病原学检测、序列测定,确定该病例为鸭1型圆环病毒与鸭3型腺病毒共感染。该文对该病例临床和实验室诊断的报道将为类似病例诊断提供参考。

1株鸭3型腺病毒的分离鉴定及fiber基因序列分析

本研究通过病毒分离、PCR和基因测序等方法,从广东某鸭场疑似“白肝病”发病鸭的肝组织样品中分离了1株鸭3型腺病毒,命名为GD2019株。序列分析结果显示,分离株fiber基因包含fiber-1和fiber-2两个片段,长度分别为1380、1443 bp。鸭3型腺病毒fiber基因非常保守,GD2019株fiber-1和fiber-2基因与已报道的鸭3型腺病毒同源性均为100%,而与其他禽腺病毒同源性则较低,亲缘关系较远。

雏番鸭鸭3型腺病毒与鸭圆环病毒共感染诊断报告

2021年5月,福清市渔溪镇郭某番鸭养殖场饲养的14日龄番鸭群发病,患鸭个体大小参差不齐、被毛杂乱,部分患鸭出现静卧蹲伏、腹泻等症状,剖检病死鸭可见肝脏肿大、斑驳样出血,肾脏肿大、出血。无菌采集患鸭肝脏、肾脏等实质性脏器进行实验室病原检测。结合该病的流行病学特点、临诊特点及实验室检测结果,初步诊断为鸭3型腺病毒与鸭圆环病毒共感染。

一株鸭腺病毒3型的分离、鉴定及致病性分析

从现地分离一株3型鸭腺病毒(duck adenovirus 3,DAdV-3)并命名为DAdV-3 YN株,分析该毒株的基因特征与致病特性,本研究选用LMH细胞进行病毒分离与纯化,并对YN株的hexon、penton base、fiber1和fiber2基因进行测序分析。通过腿部肌肉注射病毒感染7日龄番鸭,观察番鸭精神状态,记录体重变化、脏器剖检特征、组织病理学变化、计算脏器载毒量、泄殖腔拭子排毒量以及血清生化等数据,同时测定法氏囊与脾内凋亡相关基因转录水平以探究YN株对宿主免疫功能的影响。结果显示,番鸭感染YN株后体重增长受到显著抑制(P<0.01;P<0.0001);体内各脏器均出现不同程度病变,攻毒组鸭的肝组织与肾组织脏器系数均大于对照组且在攻毒后第7天差异极显著(P<0.01);攻毒组番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和尿素氮含量均显著高于对照组(P<0.001,P<0.0001);同时,法氏囊与脾内细胞凋亡相关基因mRNA水平显著上升(P<0.01;P<0.001)。以上结果提示,YN株感染7日龄番鸭后,可以导致肝和肾等脏器损伤,同时可以诱导法氏囊与脾内细胞凋亡从而影响番鸭免疫功能。

鸭腺病毒3型Fiber-2蛋白在酵母细胞中的表达及免疫原性研究

[目的]利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)系统高效表达鸭腺病毒3型(DAdV-3)Fiber-2蛋白,用于制备安全、高效、低成本的鸭腺病毒亚单位疫苗。[方法]以食品安全级的马克斯克鲁维酵母为宿主,对DAdV-3 Fiber-2蛋白进行重组表达,建立高密度发酵和纯化工艺,获得目的蛋白并制备成亚单位疫苗,然后进行动物试验。试验分为低剂量组(琼扩效价1∶64,每羽34μg)、高剂量组(1∶128,每羽68μg)、空白组和攻毒对照组,在免疫后第10天和第21天采血检测血清中的抗体水平,攻毒7 d后采肛拭子检测排毒量;通过抗体水平和排毒量评估该亚单位疫苗的保护效果。[结果]通过SDS-PAGE、Western blot和琼脂糖凝胶扩散(AGP)试验验证fiber-2基因在酵母中成功表达。重组菌经高密度发酵,目的蛋白纯化后检测其表达水平,琼扩效价可达1∶128。动物试验结果显示,疫苗免疫组在免疫后第21天所测得血清中的抗体水平显著高于空白组;疫苗免疫组在攻毒7 d后的排毒量显著低于攻毒对照组。[结论]DAdV-3 Fiber-2蛋白能在马克斯克鲁维酵母细胞中进行高效表达,并且用该蛋白制备的亚单位疫苗对鸭3型腺病毒具有一定的保护作用。

鸭腺病毒3型PCR检测方法的建立

鸭3型腺病毒(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)为近年来新发的以引起鸭肝脏肿大出血、肾脏大面积出血点为特征的鸭群新发疫病。为建立特异性的检测DAdV-3的PCR方法,研究通过分析鸭群中鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭源禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸭2型腺病毒(DAdV-2)和DAdV-3的Fiber 2基因特征,建立特异性检测DAdV-3的PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为54℃,对DAdV-3扩增片段大小为548 bp;敏感性强,最低检测限为36.4 pg;特异性好,对DAdV-A、FAdV-4、鸭病毒性肠炎(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鹅多瘤病毒(GHPV)均无特异性扩增。表明该方法可有效用于开展新发DAdV-3的流行病学调查。

鸭腺病毒3型LAMP快速检测方法的建立

鸭腺病毒3型(DAdV-3)是我国鸭群中出现的一种新型腺病毒,属于腺病毒科禽腺病毒属成员。为建立DAdV-3的快速检测方法,本研究根据DAdV-3的fiber2基因,设计特异性的LAMP检测引物,构建重组质粒标准品pT-DAdV-3,经各反应条件优化,建立了DAdV-3 LAMP快速检测方法。结果显示,建立的LAMP检测方法最佳反应条件为64℃40 min;该方法仅对DAdV-3呈阳性反应,与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源减蛋综合征病毒等其他常见鸭源传染病病原均无交叉反应,特异性强。该方法对重组质粒标准品的最低检测限为50拷贝/μL;利用本研究建立的LAMP方法、前期建立的PCR方法和基于MGB探针的荧光定量PCR方法对临床收集的66份鸭组织病料样品进行检测,结果显示阳性率分别为13.63%(9/66)、13.63%(9/66)和15.15%(10/66);且LAMP检测的阳性样品经PCR方法检测和荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究首次建立了检测DAdV-3的LAMP方法,该方法快速敏感、特异性强,为该病的流行病学调查提供技术支撑。

鸭腺病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.9989;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×10^(2)copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。

禽腺病毒DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

禽腺病毒属成员鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)和禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是养殖场主要流行的病原,对养禽业造成巨大的经济损失。目前尚未见可同时快速检测这2种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于DAdV-3 GDMM10毒株和FAdV-4 GDMZ毒株Fiber2基因序列比对及遗传进化分析,分别在Fiber2基因保守区设计特异性引物,建立了能同时鉴别临床上常见的DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,DAdV-3 GDMM10和FAdV-4 GDMZ Fiber2基因处于两个不同进化分支上,同源性为46.10%。建立的检测DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,最低可检出45拷贝/μL的DAdV-3样品和17拷贝/μL的FAdV-4样品;且检测结果可直接通过Tm值差异进行判定,简化操作时间。利用该双重荧光定量PCR方法对2022年度临床上采集的34份肝炎-心包积液疑似样品进行检测,DAdV-3和FAdV-4检出率分别为17.65%和2.94%。为进一步开展禽源DAdV-3和FAdV-4的分子流行病学及共感染致病机制奠定了基础。

鸭腺病毒3型Fiber-2基因的克隆与原核表达

鸭腺病毒3型(Duck adenovirus serotype3,DAdV-3)是近年来我国新发的鸭源腺病毒。本研究利用PCR技术扩增DAdV-3Fiber-2基因,并将其克隆至pET32a原核表达载体上,构建pET32a-Fiber-2重组表达质粒。通过菌液PCR鉴定、酶切鉴定并测序分析后,将其转化BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导pET32a-Fiber-2表达,然后进行SDS-PAGE、重组蛋白可溶性分析以及Westernblot试验。本研究利用原核表达系统成功表达出具有生物活性的DAdV-3Fiber-2蛋白,为后续开展DAdV-3Fiber蛋白的功能研究等奠定了基础。

鸭腺病毒3型Hexon基因的克隆及SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)是近年来我国新发鸭源禽腺病毒。本试验根据NCBI数据库中DAdV-3 Hexon基因特征,设计特异性引物,获得番鸭源DAdV-3福建株(命名为W1FJ株)Hexon基因全长,明确其分子特征,并基于此建立检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,克隆的W1FJ株Hexon基因全长为2 814 bp,编码937个氨基酸,和DAdV-3(CH-GD-12-2014株)核苷酸同源性为100%,但和鸭源禽腺病毒B型(也称鸭腺病毒2型,DAdV-2,GR株)核苷酸同源性仅为76.6%。Hexon蛋白遗传进化分析表明,W1FJ株和CH-GD-12-2014株在遗传进化上形成一个独立的分支,与鸭源禽腺病毒B型和鹅源禽腺病毒A型(goose aviadenovirus A)在遗传进化上明显不同,建议将其命名为鸭源禽腺病毒C型(duck aviadenovirus C)。建立的检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为61拷贝/μL;特异性强,和鸭群常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异性单峰,Tm值为(81.48±0.25)℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.49%~1.64%和0.67%~2.40%。本试验为DAdV-3的科学分类和后续开展DAdV-3感染的流行病学调查及致病机理研究奠定基础。