鸽Ⅰ型副黏病毒灭活疫苗的免疫抗体监测与分析

鸽I型副黏病毒（PPMV—I）病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽I型副黏病毒引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一。鸽I型副黏病毒病目前在各种鸽群（肉鸽、信鸽和赛鸽）中普遍存在，临床发病多见于3月龄以下的鸽，

鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗基础种子代次鉴定试验初报

为了确定鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗基础种子批的代次。本研究将鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)在SPF鸡胚上连续传至15代,初步确定第10~15代为基础种子批,对10~15代进行了无菌检验、病毒含量测定、血清学特异性试验。试验结果表明:10~15代鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)无菌,各代次病毒含量稳定(107.3~107.7 ELD50/0.1mL),血清学特异性未发生改变。因此,确定鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)10~15代为鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗毒种的基础种子批。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的田间试验

为验证鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)对鸽子的安全性和免疫效果,对试制的5批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)分别在3家规模化养鸽场进行田间试验。结果表明:幼龄鸽、青年鸽和种鸽免疫鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)后均无任何不良反应,并产生了较高的抗体水平,免疫后180 d对鸽副黏病毒Ⅰ型强毒川沙株的攻毒保护率在90%以上。试验效果证明,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)安全有效。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)灭活与乳化工艺的研究

本研究以不同浓度的甲醛溶液在不同温度下采用不同时间灭活鸽副黏病毒Ⅰ型(S-1株)病毒液,通过测定灭活效果及其灭活后对抗体阴性鸽的安全性,最终确定甲醛溶液的加入浓度为0.2%,灭活温度为37℃,灭活时间为24 h。通过测定不同水油比乳化获得的鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的稳定性,确定该疫苗的水油乳化比为1∶4。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)免疫途径研究

为了确定鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的适宜免疫途径,采用3批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)实验室制品分别以肌肉注射、皮下注射两种途径免疫30 d低抗体幼龄鸽(HI抗体≤2)和120 d低抗体青年鸽(HI抗体≤2),观察试验鸽的精神状况和疫苗的局部吸收情况,每2周对试验鸽进行一次采血,测定HI抗体,直至免疫后20周,分析两种免疫途径免疫试验鸽的临床症状和产生的抗体差异。结果表明:两种免疫途径免疫的试验鸽均无全身及局部不良反应,免疫后2周抗体在4.0 log2以上,两种免疫途径免疫抗体差异不显著(HI抗体差异在0.2 log2以内)。因此,在鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)制造及检验试行规程中规定:该疫苗的免疫途径为肌肉注射或皮下注射。

鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗保存期试验研究

为了确定鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗的保存期,对不同温度下保存不同时间的3批鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗实验室制品的物理性状、安全性和免疫效力进行了检测。试验结果表明,该疫苗冷藏(2~8℃)保存12个月、室温(25℃左右)保存6个月,其物理性状、安全性和免疫效力无明显变化,均能达到《鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗质量标准》的要求。因此,在《鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)灭活疫苗制造及检验试行规程》中规定该疫苗的保存期为:冷藏(2~8℃)保存,保存期为12个月。

上海地区鸽Ⅰ型副黏病毒F基因遗传进化及生物信息学分析

【目的】了解上海地区鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)流行毒株F基因遗传变异情况,分析F蛋白生物信息学特征,为PPMV-1的防控提供技术支持。【方法】应用RT-PCR方法扩增分离株F基因,测序并进行遗传进化分析,并通过生物信息学在线软件对F蛋白结构功能进行预测分析。【结果】分离株F基因编码区全长为1662 bp,编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株序列结构特征。系统进化树分析结果显示,分离株属于新城疫病毒(NDV)ClassⅡ群Ⅵ.2.1.1.2.2亚型,与疫苗株La Sota和Mukteswar处于不同进化分支,与国内分离株Pi/SH/CH/0617/2013和pigeon/Ningxia/2068/2016同属Ⅵ.2.1.1.2.2分支。生物信息学分析结果表明,F蛋白为亲水性蛋白,分子质量约为59.03 ku,理论等电点(PI)为7.87,半衰期为30 h,不稳定系数为35.06,脂肪系数为109.73。F蛋白主要分布在细胞质膜和内质网中,具有跨膜结构和信号肽,包含6个潜在的N-糖基化位点、13个半胱氨酸残基、103个O-糖基化位点,以及67个磷酸化位点。二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链、β-转角分别占46.11%、31.46%、18.08%及4.34%,三级结构预测结果与二级结构相一致。B细胞抗原位点预测结果显示,F蛋白含有11个抗原表位(氨基酸数目≥7)。【结论】本研究分离获得的PPMV-1分离株属于NDV ClassⅡ群Ⅵ.2.1.1.2.2亚型,其F蛋白具有较好的抗原表位,可作为PPMV-1疫苗研制和抗病毒治疗的靶蛋白。研究结果为有效防控PPMV-1感染提供了一定的参考依据,同时也为进一步研发新型疫苗奠定了基础。

一株鸽副黏病毒Ⅰ型分离鉴定及致病性分析

在天津的病死鸽病料中分离鉴定鸽副黏病毒Ⅰ型(pigeon paramyxovirus-1,PPMV-1),并对其进行遗传演化、生物学特性、致病性分析,为鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗的研发提供科学依据。采用RT-PCR方法进行病原检测,在SPF鸡胚上分离纯化病毒;经遗传演化分析、致病性分析及动物回归试验对病毒分离株进行全面分析。结果显示:病死鸽的脏器样品经RT-PCR鉴定为NDV核酸阳性;鸡胚分离纯化后得到1株鸽副黏病毒Ⅰ型毒株,命名为Pigeon/TJ/CH/020/2020(TJ20)。通过对病毒F基因测序及进化树分析,确定该分离毒株属于ClassⅡ类Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型,裂解位点的氨基酸残基为112 R-R-Q-K-R-F^(117),符合NDV强毒株的分子特征。交叉血凝抑制试验显示TJ20株与LaSota疫苗株存在明显的抗原性差异。TJ20株的鸡胚半数感染量(EID_(50))为10^(-8.38)·0.1 mL^(-1)、细胞半数感染量(TCID_(50))为10^(-8.64)·0.1 mL^(-1)、鸡胚平均致死时间(MDT)为62 h、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.19。动物感染试验结果表明,1月龄鸽人工感染TJ20株后第4天开始出现嗜睡、垂翅、腹泻、瘫痪、斜颈扭头等新城疫典型临床症状,发病率和死亡率均为100%。本研究从病死鸽组织中成功分离出一株具有高致病性的Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型的TJ20毒株,为后续鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗研发提供了重要的生物学材料。

鸽Ⅰ型副黏病毒、圆环病毒和疱疹病毒混合感染的诊断

研究旨在确诊广西某肉鸽场中出现神经症状的病鸽并为该场提供相应的防治方案,通过临床诊断、病理解剖、分子生物学检测、细菌分离、病毒分离等方法对广西某肉鸽场病鸽进行诊断。结果显示,剖检可见病鸽肝脾肿大、坏死,花斑肾;分子生物学检测结果显示,鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1)、圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)和疱疹病毒(pigeon herpesvirus,PiHV)为阳性;对病样进行细菌培养,结果未分离到细菌;将病样接种SPF鸡胚进行病毒分离,结果显示,尿囊液血凝效价稳定在8 log2,其血凝性可被新城疫病毒(NDV)阳性血清抑制,但不能被禽流感病毒(AIV)阳性血清抑制。研究表明,最终诊断结果为PPMV-1、PiCV和PiHV混合感染。

鸽副黏病毒油乳剂灭活疫苗不同水油比的研究

为了减少鸽副黏病毒油乳剂灭活疫苗的副作用,保证疫苗的安全性及免疫效果,利用分离到的鸽Ⅰ型副黏病毒(S-1株)作为抗原,配制了不同水油比的疫苗,对疫苗的物理性状、安全性、效力试验及免疫效果进行观察,探究疫苗不同水油比的差异。结果表明:该疫苗的水油乳化比为1:4时,疫苗的稳定性最好、免疫效果最佳。

广东地区鸽禽Ⅰ型副黏病毒分离株生物学特性研究

鸽禽Ⅰ型副黏病毒（Avian Paramyxovirus TypeⅠ，PA／PMV—Ⅰ）感染，因其病原及症状均与鸡新城疫（ND）十分相似，通常又称之为鸽新城疫，或鸽瘟，是鸽的一种急性烈性传染病。近年来我们从广东的深圳、东莞、广州市郊等地区发病鸽群中分离并鉴定到23株禽Ⅰ型副黏病毒，对其中6株病毒进行生物学特性研究。

鸽Ⅰ型副黏病毒与沙门氏菌、大肠杆菌混合感染的诊断

从珠三角某鸽场病死鸽中无菌操作采取心血、肝脏、脑、脾脏,接种于麦氏培养基和木糖—赖氨酸—脱氧胆酸琼脂培养基,经细菌纯化、镜检、生化试验、PCR检测和药敏试验,结果显示30只病鸽有8只分离到沙门氏菌,阳性率为26.7%;10只分离到大肠杆菌,阳性率为33.3%;其中6只同时分离到沙门氏菌和大肠杆菌,混合感染率为20.0%。经病毒分离培养、PCR检测,结果显示从6个混合样品中分离到5株副黏病毒,分离率为83.3%。结果表明,该鸽场鸽群发生了副黏病毒、沙门氏菌、大肠杆菌混合感染。本试验对珠三角鸽场近年较常发生的、以乳鸽较严重发病死亡的典型疫情作了较明确的诊断。

1株鸽Ⅰ型副黏病毒的分离与鉴定

本试验采集病死鸽临床样品,用SPF鸡胚接种传代分离病毒后,通过血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、RT-PCR及F基因部分片段测序与分析对分离株进行鉴定,并通过测定鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和动物回归试验评估分离株的毒力和致病性。结果表明,从病鸽组织病料中分离获得1株鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1),命名为GXP120012。分离株GXP120012的F基因裂解位点112-117位的氨基酸组成为R-R-Q-K-R-F,符合强毒株特征;GXP120012与PPMV-1参考毒株pi/CH/LLN/110713的核苷酸序列同源性高达98.9%,并处于同一遗传分支,基因型为Ⅵ型。该分离株的MDT为102h,ICPI为0。动物回归试验发现,分离株GXP120012对鸽具有较强的致病性,而对鸡没有致病力。本试验结果为今后鸽新城疫的分子流行病学研究和疾病防控提供理论依据。

鸽副黏病毒Ⅰ型S-1株的分子特性分析

对从上海郊区发病鸽场分离鉴定的鸽副黏病毒Ⅰ型S-1毒株进行分子特性分析,选取融合蛋白F基因片段设计特异性引物,用RT-PCR扩增F基因cDNA片段,并将其克隆到pGEM-T载体中。序列分析结果表明,分离株的F基因片段为1666 bp,包含完整的F基因,编码553个氨基酸,其F蛋白与常见疫苗株B1、La Sota、V4的氨基酸同源性分别为89.2%、89.0%和91.5%;与国内鸽分离株YN P1、ch 98-1和STP96的氨基酸同源性分别为91.2%、93.9%和94.6%;与国外鸽分离株116600、248VB、Capital 397、IT-22782和Tigre 699的同源性分别为95.7%、96.0%、95.1%、99.1%和95.5%。PPMVS-1分离株的F蛋白裂解位点序列为112G-R-Q-K-R-F117,属于基因Ⅵ型中等毒力的鸽Ⅰ型副黏病毒。

鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)的分离与鉴定

利用SPF鸡胚培养法从上海川沙某具有典型新城疫症状和病理变化的高死亡率发病鸽场的死亡鸽体内分离到一株病毒。对该病毒E5代尿囊液进行病原学鉴定、RT-PCR鉴定、理化特性测定、致病指数、病毒血清学试验及鸽体致病性试验,结果显示该病毒具有血凝性,且血凝特性可被新城疫病毒参考阳性血清所抑制,而不能被减蛋综合征病毒、禽流感病毒(H5、H9和H7)阳性血清抑制;该病毒对氯仿、乙醚和酸敏感;致病指数分别为:最小致死量鸡胚平均死亡时间为55.2 h,1日龄雏鸡脑内致病指数为1.8,6周龄雏鸡静脉致病指数为2.39。经鉴定,该分离毒株为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株,将其命名为鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)。

鸽副黏病毒Ⅰ型(S-1株)的分离与鉴定

利用SPF鸡胚培养的方法对上海郊区疑似发生鸽副黏病毒Ⅰ型感染的鸽场病料进行病毒分离,病料上清液在10～11日龄SPF鸡胚上盲传5代,鸡胚死亡时间趋于规律性,鸡胚在接种72h内死亡90%以上,死亡胚全身出血;通过对病毒液进行病原学鉴定(该病毒液具有HA,这种血凝性可被NDV参考阳性血清抑制,而不能被EDSV、AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7阳性血清抑制)、致病指数(采用SPF鸡胚和SPF鸡测定致病指数分别为MDT=64.8h、ICPI=1.3625、IVPI=0.75)及鸽体致病性等试验,初步鉴定为鸽副黏病毒Ⅰ型中等毒力毒株,命名为鸽副黏病毒Ⅰ型(S-1株)。

鸽Ⅰ型副黏病毒病的研究进展

鸽Ⅰ型副黏病毒病是一种流行于鸽群的急性传染病。该病传播迅速,发病率和死亡率高,是危害养鸽业的主要疫病之一,已对养鸽业造成了较大的经济损失。本文就鸽Ⅰ型副黏病毒病的病原特性、流行病学、临床症状和剖检病变、诊断和预防措施进行了简要综述。

鸽Ⅰ型副黏病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备鸽Ⅰ型副黏病毒融合蛋白(F蛋白)的单克隆抗体,以鸽Ⅰ型副黏病毒F基因抗原重组蛋白免疫BALB/C小鼠,得到能稳定分泌抗F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞3株。对效价最高的一株进行特性测定,结果显示其腹水抗体效价达到6.4×104以上,细胞培养上清液的效价达1︰800,其抗体亚类为lg G 2b,轻链为κ链,染色体数目为98条;血凝抑制试验显示单抗没有血凝抑制效价;间接ELISA进行特异性试验表明单抗与鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合征病毒、鸡马立克氏病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、羊痘病毒、大肠杆菌、沙门氏菌没有交叉反应,而与鸡新城疫病毒具有较强的交叉反应。PPMV-1 F蛋白单克隆抗体的制备为鸽Ⅰ型副黏病毒病新诊断方法的建立奠定了基础。