鹅源禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的生物学特性

对新近分离到的鹅源禽副粘病毒 GPMV/QY97-1株的生物学特性进行了研究。结果表明 ,该病毒粒子在电镜下呈球形 ,直径 1 2 1～ 2 50 nm,表面有纤突 ,能凝集鸡的红细胞 ,血凝反应能被 I型禽副粘病毒阳性血清所抑制 ,由此初步判定该病毒属于 I型禽副粘病毒。该病毒人工感染 1、1 4、2 8、4 8日龄的鹅 ,发病率均为1 0 0 %,致死率分别为 1 0 0 %、87.5%、62 .5%、1 2 .5%;人工感染 2 5日龄的鸡 ,发病率和致死率均为 1 0 0 %;

鹅Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株HN基因的克隆和序列分析

在华南地区进行鹅病病因的调查过程中,从患病鹅群中分离到一株对鹅和鸡都有致病力的病毒,初步判定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为GPMV/QY97-1株。以GPMV/QY97-1毒株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法,扩增出血凝素-神经氨酸酶(HN)基因3′端和5′端的cDNA片段,分别将其克隆至pGEM-TEasy载体中,对其进行序列测定。序列分析表明,HN基因的cDNA全长为2024nt,编码571个氨基酸。序列中含有13个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其HN基因及编码蛋白结构与新城疫病毒株相符。将GPMV/QY97-1株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫病毒株的HN基因相应序列做比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在89 6%～83 6%,氨基酸序列同源性在93 3%～87 9%。在同源性比较的基础上,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病学调查有着重要意义。

鹅副粘病毒分离株生物学特性的研究

鹅副粘病毒病是一种新发现的由副粘病毒引起的能引起不同年龄鹅发病、以消化系统损害为主的传染病。本研究对一野毒株 (NA_1)应用鸡胚传代、电镜形态学观察、红细胞凝集_红细胞凝集抑制试验、鹅体回归试验、实验免疫保护试验等进行了研究 ,并进行了三项毒力指标的测定。依据国际上判定新城疫病毒毒力的标准 ,NA_1毒株均具有与新城疫病毒速发型相似的毒力 ,属于强毒力的毒株。应用NA_1毒株制备的油乳剂灭活苗实验免疫雏鹅 。

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株YG97经 10日龄鸡胚增殖后纯化 ,提取病毒的基因组RNA ,采用RT_PCR一次性扩增出与预期设计的 1.7kb大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pGEMR_T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的F基因片段的长度为16 95bp ,共编码 5 5 3个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112 R_R_Q_K_P_F117,与NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符。同源性分析表明 ,与国内标准强毒株F48E9的核苷酸同源性为 86 % ,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在 82 %～ 89%之间 。

鹅副粘病毒的人工感染试验

鹅副粘病毒是最新发现的，能引起各种年龄鹅发病的并致死的一种病毒。我们通过ＳＰＦ鸡胚分离的病毒尿囊液第４代，对鹅进行人工感染试验。结果表明，人工感染后，成年鹅群的发病率达到１００％，死亡率达３０％，１５日龄雏鹅感染后发病率和死亡率均达到１００％，这与自然发病鹅群的发病率和死亡率基本相同，而且人工感染后不管成年鹅还是雏鹅其临床病状和病理变化均与自然发病的鹅的病理变化相同，从而证实了该病理分离株的致病性及病原性。

鹅副粘病毒毒力特性的研究

新城疫病毒毒力的判定标准是根据国际上规定的三项指标 ,即最小致死量致病鸡胚平均死亡时间 (MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数 (ICPI)和 6周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数 (IVPI) [1] 等加以评价。作者从实验室分离到的 11株鹅副粘病毒中选取了其中的 3株 ,即HG97C5、YG97F11、YG98_2 C4 ,按照新城疫病毒毒力判定的标准方法进行了一系列致病性试验 ,结果 3株鹅副粘病毒的MDT分别为 5 6 .7、5 2 .0、5 3.2 ,ICPI分别为 1.6 4、1.6 9、1.70 ,IVPI分别为 2 .6 2、2 .6、2 .6 ,表明这 3株鹅副粘病毒均具有与新城疫病毒速发型相类似的毒力。同时 ,我们也应用鹅胚和鹅按照研究新城疫病毒毒力的方法进行了相应的毒力试验 ,结果 ,这 3株鹅副粘病毒最小致死量致死 13日龄鹅胚的平均死亡时间分别为 6 8.8、6 7.4、70 .2 ,1日龄雏鹅脑内接种致病指数分别为 1.5 2、1.6 4、1.6 6 ,6周龄非免疫雏鹅静脉接种致病指数分别为 1.2 6、1.6 5、1.6 75。目前虽然没有鹅副粘病毒毒力判定标准 ,但从其对鸡和鹅的致病性检测结果表明这

鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析

以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。

鹅源副粘病毒NA-1株F蛋白基因的克隆及其载体的构建

鹅源副粘病毒分离株 NA- 1经 1 1日龄鸡胚增殖后收集尿囊液 ,浓缩 ,提取病毒基因组总 RNA,采用 RT- PCR方法 ,一次性扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯回收后克隆入 p MD1 8- T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,对阳性克隆进行了序列测定和序列分析。测序后拼接的 F基因长 1 6 72 bp,包含完整的开放阅读框 ( 1 6 6 2bp) ,编码 5 5 3个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 R- R- Q- K- R- F1 1 7,与 NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。根据 NDV基因分型标准 ,鹅源副粘病毒 NA- 1株归属基因 型 NDV。将 F基因克隆入转座载体 p Fast Bac ,得到重组转座载体 PFF,将 PFF转化大肠杆菌 DH1 0 Bac,提取质粒 ,得到阳性重组穿梭载体 re- Bacm id。

鹅副粘病毒病的研究

用ＳＰＦ鸡胚分别从扬州市不同患病鹅群的病鹅肝、脾等病料中分离到５株病毒。鸡胚分离的病毒株均具有凝集鸡红细胞，ＨＡ为２７～１４，并被康复血清所抑制。毒价ＥＬＤ５０为１０１１．２４，人工感染易感鹅引起发病死亡，与自然病例的症状和病变相同，并能在鹅群中流行传播。３株鸡胚绒尿液毒作负染电镜观察，病毒颗粒均呈大小不一、形态不正、表面有密集纤突结构，病毒内部由囊膜包裹着的螺旋对称的核衣壳，大小平均直径为１２０ｎｍ。根据血清学检测、病毒形态结构及特性等初步的研究结果表明，该病分离毒株为副粘病毒科副粘病毒属一员。应用分离毒研制的灭活苗经试验表明有良好的保护率。

鹅副粘病毒病的研究

用ＳＰＦ鸡胚分别从扬州市不同患病鹅群的病鹅肝、脾等病料分离到５株病毒。鸡胚分离的病毒株均凝集鸡红细胞，ＨＡ为２７～１４，并被康复血清所抑制。毒价ＥＬＤ５０为１０１１．２４，人工感染易感鹅引起发病死亡，有与自然病例相同的症状和病变，并能在鹅群中流行传播。三株鸡胚绒尿液毒作负染电镜观察，病毒颗粒均呈大小不一，形态不正，表面有密集纤突结构，病毒内部由囊膜包裹着的螺旋对称的核衣壳，大小平均直径为１２０ｎｍ。根据血清学检测、病毒形态结构以及特性等初步的研究结果，本病分离毒株为副粘病毒科、副粘病毒属一员。用分离毒研制的灭活苗经试验表明有良好的保护率。

鹅副粘病毒病流行病学和血清学研究

1997年7月以来，来我校兽医院就诊的76例鹅副粘病毒病，群体内发病率和死亡率很高，10日龄以内的雏鹅发病率和死亡率均达到100％，平均发病率和死亡率分别为对27.7％和18．2％。种鹅群感染后能引起产蛋率迅速下降。与鹅同时饲养的鸡也能感染发病。不同患病阶段鹅的HI抗体逐渐升高，高峰期平均抗体滴度为212，然后逐渐下降，并在27-8的水平上维持一段时间。接种疫苗能有效地控制该病。

鹅副粘病毒病油乳剂灭活苗的研究

鹅副粘病毒病是 1997年本组王永坤等首先发现的一种新的鹅的烈性传染病 ,发病率和死亡率分别达 2 7.7%和 18.2 %。为了控制该病的流行传播 ,本课题组在研究该病的病原特性和防制方法的基础上 ,尽快研制了油乳灭活疫苗。从该疫苗的免疫结果观察 ,疫苗在免疫后第七天即可产生抗体 (平均为 2 3 .9) ,15天达到 2 6.7,30天可达到 2 8.8;从免疫保护试验看 ,免疫后 15天 ,用强毒攻击 ,免疫组全部保护 ,而对照组 5只鹅全部发病 ,3只死亡。从区域性中试调查结果来看 ,该苗安全、有效 ,能较好地控制该病的流行。

鹅副粘病毒病的病理变化

对国内最近报道的一种新的传染病鹅副粘病毒病的自然病例和人工感染病例进行了系统的病理学观察。结果表明 ,自然病例和人工感染病例的病理变化基本一致。主要肉眼病变为肠道粘膜广泛出血、坏死、溃疡 ;脾脏、胰腺出现粟粒样白色坏死点 ;胸腺、法氏囊体积缩小 ;脑水肿、充血。主要组织学变化为肠道粘膜上皮细胞严重坏死、脱落 ;肝、心、肾等器官实质细胞变性、坏死 ;胸腺、脾脏、法氏囊的淋巴细胞坏死 。

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA_1经 11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA ,采用RT_PCR扩增出与预期设计的 1 7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD 18_T载体 ,经纯化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆 ,并对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为 174 0bp ,该基因的ORF总长为 1716bp ,编码 5 71个氨基酸。与GenBank下载的 15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测NA_1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为 97 3% ,与F48E9同源性为 84 5 % ,与LaSota为 82 2 %。

鹅副粘病毒感染鸡试验

本室分离的鹅副粘病毒是一株对鹅具有较强致病力的病毒,它也能实验感染雏鸡,且雏鸡感染后发病率均为100% ,死亡率50% 以上。人工感染的鸡其症状和病理变化均与鹅自然发病的病变相类似。从感染途径看,注射及接触( 混养)均能感染发病,并且在感染发病及死亡时间上也与鹅感染情况相似,因此该病毒感染鹅同时又能实验感染雏鸡,而且传播之迅速。

鹅源禽副粘病毒NA-1株生物学特性的研究

对从吉林省分离的鹅副粘病毒NA-1株应用SPF鸡胚进行传代,通过电镜形态学观察、HA及HI试验、血清学鉴定、毒力鉴定、AGID试验、血凝谱的测定、动物感染试验等一系列研究,发现NA-1株属于禽副粘病毒Ⅰ型,具有新城疫病毒速发型相似的毒力,属于强毒力毒株,遗传进化树分析属于基因Ⅶ新城疫病毒。该病毒对鹅、鸡均具有高致病性。

鹅副粘病毒不同来源分离株血凝特性及ELD_(50)的比较

鹅副粘病是一种新发现的由副粘病毒引起的能引起不同年龄鹅发病和不同程度致死的疾病。为了研究其病毒特性 ,我们用分离鉴定的 11株鹅副粘病毒 ,分别在SPF鸡胚传代至 2～ 11代后用鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑的红细胞作血凝试验 ,测出各毒株的凝集价 ,证明所分离的 11株病毒均不同程度地凝集上述 5种禽类的红血球。同时分别测定 10株病毒的ELD50 ,结果表明各毒株的ELD50 在 8～

鹅副粘病毒与鹅细小病毒主要免疫原性基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的共表达及其免疫

根据测得的鹅源副粘病毒(GPMV)NA-1株F基因序列,设计1对特异性引物,用作者构建的含F基因的质粒pGF为模板,PCR扩增F基因片段(去除终止密码子),与转座载体pFastBac连接,构建重组质粒pFastBac-F,并进行测序鉴定;根据测得的鹅细小病毒(GPV)GD-01株VP3基因序列,设计1对特异性引物,用作者构建的重组质粒pGVP3为模板,PCR扩增出有Linker的VP3基因(命名为LVP3)。再将重组质粒pFastBac-F与LVP3片段连接,构建重组转座载体pFF-LVP3,转化到DH10Bac宿主菌,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得重组Bacmid F-L-VP3转染Sf9昆虫细胞,所表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,特异蛋白分子质量约123 000。将表达蛋白免疫雏鹅,经抗体测定证明,表达的F-VP3重组蛋白能诱导机体产生特异性免疫应答。

雏鹅实验性副粘病毒病的临诊症状及病理变化研究

用鹅副粘病毒BY株人工感染 5日龄雏鹅 ,观察试验鹅的临诊症状和病理学变化。试验鹅最早于 2d出现症状 ,3d开始死亡 ,死亡高峰期在 3～ 5d ,7d后停止死亡 ,总计试验鹅发病率为 89 19% ,死亡率为 6 4 86 %。主要临诊症状为精神不振 ,食欲降低或废绝 ,拉稀 ,流泪 ,流鼻液。主要大体病变为消化道粘膜的水肿、出血、坏死以及胰腺、脾脏组织的严重坏死。主要组织学变化为腺胃、肠道粘膜上皮细胞和胰腺腺泡上皮细胞严重变性、坏死 ,胸腺、脾脏、法氏囊等器官内淋巴细胞坏死、崩解 ,数量显著减少。

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPVSF0 2毒株的基因组RNA为模板 ,通过RTPCR方法扩增出HN基因片段 ,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序 ;测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列 ,所测GPVSF0 2毒株与参考毒株NL 96核苷酸序列的同源性为 86 %。