葡萄糖对鹅原代肝细胞脂质沉积相关基因及酶活性的影响

通过用葡萄糖培养天府肉鹅（A nser cygnoides）原代肝细胞的试验，探讨葡萄糖对肝细胞脂质合成能力的影响．研究发现：0～25mmol／L葡萄糖对肝细胞上清液中谷草转氨酶（aspartate transaminase, AST）、谷丙转氨酶（alanine amiotransferase, ALT）浓度没有显著影响，35mmol／L葡萄糖影响显著，但AST、ALT浓度均在正常范围内，表明肝细胞功能正常；油红氧染色实验结果表明：葡萄糖处理后显著增加细胞内脂滴集聚和脂质沉积；25、35mmol／L葡萄糖能显著增加乙酰辅酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylasea, ACCα）、脂肪酸合成酶（fattyacid synthetase, FAS）酶活性；5、25、35mmol／L葡萄糖都能显著增加ACCα、FAS基因mRNA表达量．因此．葡萄糖能通过上调ACCα、FAS基因mRNA表达量及酶活性诱导肝细胞内脂质沉积．

胰岛素对鹅原代肝细胞增殖及蛋白合成的影响

通过用不同浓度胰岛素培养天府肉鹅（Ansercygnoides）原代肝细胞探讨胰岛素对鹅原代肝细胞增殖及蛋白合成的影响。结果表明：与对照组相比，0—200nmol／L胰岛素对肝细胞上清液中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）浓度没有显著影响，表明细胞功能正常；100、150和200nmol／L胰岛素显著增加细胞培养上清液中总蛋白（什）和白蛋白（ALB）浓度；Brdu．ELISA法检测DNA合成实验结果表明经胰岛素处理后显著增加鹅原代肝细胞增殖率。因此，胰岛素能促进鹅原代肝细胞的细胞增殖及蛋白合成。

葡萄糖对鹅原代肝细胞增殖的影响

【目的】探讨葡萄糖对鹅肝细胞增殖能力的影响。【方法】以四川白鹅为供试动物,采用半原位二步胶原酶灌注法采集鹅的肝细胞,之后用含不同浓度(0(对照组,CK),5,20,35mmol/L)葡萄糖的培养基培养鹅原代肝细胞,培养48h后用BrdU免疫荧光染色检测BrdU阳性细胞率,BrdU-ELISA法检测肝细胞DNA含量,ELISA法检测Cyclin D1蛋白质量浓度。反转录聚合酶链式反应检测细胞增殖相关基因(Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3)的mRNA表达水平。【结果】与对照组比较,20和35mmol/L葡萄糖可以显著增加BrdU阳性细胞率,并可以明显提高原代肝细胞的DNA含量;5和20mmol/L葡萄糖对Cyclin D1蛋白质量浓度影响不显著,而35mmol/L葡萄糖对Cyclin D1蛋白质量浓度有显著促进作用。Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin D3的mRNA表达水平随着葡萄糖浓度的增加而升高,其中35mmol/L葡萄糖的促进作用明显大于其他处理。【结论】葡萄糖能够促进鹅原代肝细胞的增殖。

甜菜碱对鹅胚原代肝细胞脂肪代谢和DNA甲基化的影响及调控机制

本试验旨在研究甜菜碱对鹅胚原代肝细胞脂肪代谢和DNA甲基化的影响及调控机制。以鹅胚原代肝细胞为试验对象,试验1:研究不同浓度[0(对照)、2.5、5.0和10.0 mmol/L]甜菜碱培养液对鹅胚原代肝细胞DNA甲基化相关酶活性和泛酰巯基乙胺酶-1(VNN-1)启动子区域DNA甲基化的影响;试验2:研究不同处理[正常培养液(对照)、5.0μmol/L DNA甲基化酶抑制剂(AZA)、5.0 mmol/L甜菜碱、5.0μmol/L AZA+5.0 mmol/L甜菜碱]培养液对鹅胚原代肝细胞VNN-1和脂肪酸合成酶(FAS)基因表达的影响,探索VNN-1启动子区域甲基化调控基因表达的分子机制。结果表明:1)2.5、5.0和10.0 mmol/L甜菜碱组肝细胞的低密度脂蛋白(LDL)含量显著低于对照组(P<0.05)。2)S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸(SAM/SAH)比值随着甜菜碱浓度的增加呈上升趋势,呈显著一次线性关系(P<0.05)。3)5.0和10.0 mmol/L甜菜碱组肝细胞VNN-1基因表达量显著低于对照组和2.5 mmol/L甜菜碱组(P<0.05);5.0和10.0 mmol/L甜菜碱组肝细胞VNN-1启动子区域DNA甲基化水平显著高于对照组(P<0.05)。4)AZA处理96 h时,AZA组和AZA+甜菜碱组肝细胞中VNN-1基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,处理48 h时,AZA处理显著提高了肝细胞中FAS基因表达量(P<0.05)。综上所述,鹅胚原代肝细胞培养液中添加甜菜碱能抑制肝细胞的脂质积累,提高细胞总体的DNA甲基化水平,且VNN-1启动子区域的甲基化负反馈调节其基因表达。AZA抑制DNA甲基化后发现VNN-1和FAS的高表达与DNA去甲基化相关。

鹅肥肝形成中补体受体1基因的表达和调控研究

试验旨在探讨鹅补体受体1(CR1)基因在鹅肥肝形成中的表达和调控机制。通过荧光定量PCR验证CR1在填饲19 d鹅肝脏中的表达情况,通过体外细胞(鹅原代肝细胞)试验探索脂肪肝相关因子(葡萄糖、胰岛素、油酸和棕榈酸)对CR1的诱导作用,同时通过分析CR1基因的上游序列预测其转录调控因子并通过药物处理进行验证。结果发现,CR1基因在填饲19 d肥肝中的表达量显著高于对照组;25 mmol/L葡萄糖以及各处理浓度的油酸(0.125、0.25和0.5 mmol/L)均可导致鹅原代肝细胞中CR1表达水平的显著上调,胰岛素对CR1的表达水平没有显著影响,而0.5 mmol/L棕榈酸则对CR1在鹅原代肝细胞中的表达有一定的抑制作用;序列分析发现,鹅CR1上游序列含有肝细胞核因子1(HNF1)的结合位点,且使用HNF1的活性调控剂(鹅去氧胆酸)处理鹅原代肝细胞后,鹅CR1基因的表达量显著上调。综上,本研究证实CR1基因在鹅肥肝形成过程中表达水平的显著上调,并对其可能的调控机制进行初步探索,为深入研究补体系统在鹅肥肝形成中的作用和机制奠定了基础。

鹅肝细胞的高纯分离及培养

采用简单的"胶原酶直接消化法"分离鹅胚胎肝细胞,得到的肝细胞纯度高,活性好;HE染色显示大量双核或多核细胞,细胞具有旺盛增殖分裂能力;肝脏特异性基因白蛋白基因检测显示所分离细胞为成熟肝脏细胞。该法操作简单、高效,是获得鹅原代肝细胞的一种较好的方法,有利于以鹅原代肝细胞为模型的体外研究工作的开展。