鹅源腺病毒全基因组DNA酶切片段的克隆

利用 1株鹅源腺病毒 Y81G4 株 ,经鹅胚增殖后收获尿囊液 ,用差速离心法纯化病毒子并提取病毒基因组 DNA.病毒 DNA经 H ind 酶切后共产生 1 0个片段 ,分别回收各酶切片段 ,与经 H ind 单酶切的p UC1 8连接 ,获得 8个不同的重组质粒 .对于未克隆到的两末端片段 ,经碱处理去除末端蛋白后 ,以平端和 H ind 粘端与经 Sma 和 H ind 双酶切的 p UC1 8连接 ,获得了重组质粒 p GAHC和 p GAHI.克隆的各酶切片段 ,通过酶切电泳和 Southern blotting结果鉴定 ,证明已分别克隆到该病毒基因组 DNA H ind 酶切片段 ,且各酶切片段大小之和约为 3 2 .

鹅源腺病毒Y_(81)G_(4)株基因组末端倒置重复序列(ITR)的核酸鉴定和结构分析

对鹅源腺病毒株Y81G4 基因组两侧末端序列测定和比较 ,鉴定出其ITR区。Y81G4 株ITR全长为 12 5bp ,远长于其它禽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群腺病毒ITR长度。在Y81G4 株ITR中有一些腺病毒ITR序列特征 :① 5 _C(A/T) (A/T)NTCAT_腺病毒典型起始序列 ;② 9～ 13bp存在腺病毒科共有的 (A/T)T(A/T)ATA保守序列 ;③在ITR区 37～ 42bp出现的GNGGCG保守序列 ;④在ITR 45～ 5 0bp出现TGACGT保守序列。此外 ,哺乳动物腺病毒ITR中被转录因子SP1所识别的序列和以增强DNA复制启动的两个宿主核蛋白NFⅠ和NFⅢ的结合序列在Y81G4 株TIR中并没有出现。经DNASTAR软件“Clustal”方法对禽腺病毒Y81G4 株ITR与其它腺病毒ITR的同源性进行比较 ,其同源性由高到低依次为 :禽Ⅲ群减蛋综合征病毒 (EDSV ,10 0 % ) >羊腺病毒 (OAV ,43 .5 % ) >禽Ⅱ群火鸡出血性肠炎病毒 (HEV ,30 .8% )和禽Ⅰ群鸡胚致死孤儿病毒 (CELO株 ,2 8.2 % ) >人腺病毒 12型 (HAd12 ,2 6 .4% )和牛腺病毒 1型 (BAd1,2 6 .4% )。通常在腺病毒科同一亚属或亚群中ITR是很保守的 ,因而推测Y81G4

鹅源腺病毒基因组DNA物理图谱的构建

将鹅源腺病毒Y81G4 株全基因组DNA的HindⅢ酶切片段分别插入质粒 pUC18,成功构建了全基因组DNA文库。在此基础上 ,将重组质粒携带的插入片段切出、回收并分别用地高辛标记后作为探针 ,与经限制酶BamHI、EcoRI、PstI、EcoRV消化的病毒基因组DNA进行SouthernBlotting ,杂交结果经比较综合后获得了该病毒基因组DNA的HindⅢ、BamHI、EcoRI、PstI、EcoRV限制性内切酶的物理图谱。利用已发表的含有鸡EDS76病毒AA 2株基因组DNA右末端的重组质粒pBE4 2作为探针 ,与本病毒两末端重组质粒进行SouthernBlotting ,根据同源性杂交结果确定了本病毒基因组DNA物理图谱与EDSVAA 2株相应的方向。本病毒基础因组DNA物理图谱的精确构建 ,为进行基因组结构分析 ,筛选复制非必需区 。

鹅源腺病毒基因组E3区的鉴定和分析

在构建鹅源腺病毒Y81G4株Hind文库的基础上,通过特定的引物采用PCR方法从腺病毒文库的A片段中扩增并序列分析鉴定了腺病毒的E3区。E3区二端分别是保守性较强的pⅧ基因和纤维蛋白基因。和人腺病毒E3区相比,鹅源腺病毒E3区具有以下二个显著特征:(1)长度较短,全长仅为238个核苷酸;(2)E3区不具有明显的编码框。本研究也进一步证实了此鹅源腺病毒应归类于Ⅲ型禽腺病毒。