两种不同方法检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠的对比分析

本文探讨生化法与高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)结果的相关性。根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)EP9-A文件,每天取临床样本8份,分别采用自主研发的体外诊断生化试剂和HPLC-MS/MS测定血清GCDC含量,共测定5d,记录结果,去除离群点,计算线性回归方程和相关系数,进行偏倚估计,对比生化试剂测量的准确性。通过试验得出生化法和HPLC-MS/MS方法检测血清GCDC的相关方程为Y生化法=0.9642XHPLC-MS/MS-1.2266,相关系数(r)=0.9954,两种方法结果高度相关,有很好的可比性;两种血清中GCDC检测结果具有很好的可比性,由于检测原理和仪器不同,当采用不同方法时,应对其进行对比分析和偏倚评估。

鹅胆汁中鹅脱氧胆酸和胆红素提取工艺研究

鹅脱氧胆酸(CDCA)和胆红素均是鹅胆中的主要活性成分。将鹅胆通过皂化、中和、分层等步骤,同时从中分离提取出鹅脱氧胆酸和胆红素。通过单因素实验和正交实验确定了皂化温度、皂化时间和NaOH浓度的最佳条件。实验结果表明,当皂化温度为90℃,皂化时间为1h,NaOH浓度为8%时,CDCA的提取量为0.9mg/g,胆红素的提取量为0.46mg/g。

甘氨鹅脱氧胆酸盐对人正常肝细胞HL-7702的影响

目的观察甘氨鹅脱氧胆酸盐(glycochenodeoxcholate,GCDC)对人正常肝细胞HL-7702凋亡诱导作用,探讨GCDC诱导HL-7702细胞凋亡的机制。方法终浓度分别为50、100、150、200、250μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞4、8、12、24h,光学显微镜镜下观察细胞形态学改变、用Am-Blue细胞活性检测和乳酸脱氢酶活性的测定及AnnexinV-FITC/PI双染色法检测GCDC对HL-7702细胞凋亡的影响,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度。结果 (1)终浓度为150μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变,包括核固缩、核碎裂和凋亡小体形成等。(2)Am-Blue吸光光度法、GENMED乳酸脱氢酶(LDH)总活性比色法及AnnexinV-FITC/PI双染色法定量检测结果均显示,GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡且呈剂量及时间依赖性。(3)GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加且具有浓度和时间依赖性。结论 GCDC可能通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡,其作用具有浓度和时间依赖性。

鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200诱导人肝癌细胞株凋亡的作用及机制

鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200可有效地抑制肝肿瘤细胞株BEL7402的生长,其作用随药物浓度提高和作用时间延长而增强,呈一定的剂量、时间依赖性;鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200对人肝肿瘤细胞株BEL7402有显著的生长抑制作用,该生长抑制作用与HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡有关;HS-1200对正常肝细胞株无生长抑制及诱导凋亡的作用.HS-1200诱导凋亡的机制可能是HS-1200提升Bax而降低Bcl-2的表达,从而使线粒体膜通透性增高,使细胞色素C由线粒体释放入胞质,活化caspase-9,活化的caspase-9切割pro-caspase-3生成caspase-3,从而诱导凋亡;但上述凋亡过程中caspase-8特异性抑制剂未改变HS-1200诱导的凋亡,因而HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡途径为内源性凋亡途径.

PI3K/AKT/mTOR信号通路对甘氨鹅脱氧胆酸钠诱导的肝细胞凋亡的机制研究

目的:探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路对甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)诱导的人肝正常细胞HL-7702增殖、凋亡的影响。方法:将HL-7702细胞分为对照组、GCDC组(1 mmol/L的GCDC预处理细胞4 h)、GCDC+LY294002组(GCDC处理细胞4 h后,使用15μmol/L的LY294002处理细胞24 h)和GCDC+IGF-1组(GCDC处理细胞4 h后,使用20 nmol/L的IGF-1处理细胞24 h)。处理结束后,通过Western blot检测PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax和Nrf2蛋白表达;MTT法及Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞增殖和凋亡率;DCFH-DA探针法检测细胞活性氧(ROS)含量。结果:GCDC可明显下调HL-7702细胞PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bcl-2和Nrf2表达,上调Bax表达,抑制细胞增殖,诱导凋亡,诱导细胞ROS产生(P<0.05),LY294002可增强GCDC对HL-7702细胞增殖、凋亡、ROS水平及PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bcl-2、Bax和Nrf2表达影响,IGF-1反之。结论:激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可改善胆汁性肝纤维化,机制可能与抗凋亡和抗氧化有关。

甘氨鹅脱氧胆酸钠致阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中bcl-2 mRNA的表达意义

目的:探讨bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中的调控作用。 方法:健康(?)Wistar大鼠,进腹,游离出胆总管,于肝门部结扎胆总管并切断,远端再予以结扎。进腹后不结扎切断胆总管作为阴性对照。结扎后3,7,14,21d处死大鼠,每组8只。采用胶原酶原位肝灌注法获取体外培养正常大鼠及阻塞性黄疸大鼠肝细胞。分别收取正常大鼠及胆总管结扎大鼠肝细胞1×10~9/L^(-1),用Trizol试剂盒一步法提取大鼠肝细胞总RNA,行RT-PCR扩增;用PCR扩增bcl-2,和对照β-actin基因片段;分离的正常大鼠及胆总管结扎14 d大鼠的肝细胞行原代培养,培养板内置小飞片,使用100μmol·L^(-1)甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)作用于两组肝细胞24h后,用FCM法分析肝细胞的凋亡比率,用TUNEL技术进行肝细胞凋亡的原位检测。 结果:体外培养正常大鼠及结扎3d大鼠肝细胞bcl-2 mRNA的表达为阴性,仅见β-actin条带;胆总管结扎大鼠体外培养肝细胞在结扎后7d即可见肝细胞内bcl-2 mRNA的表达,其吸光度A值为0.13±0.15;结扎后14、21d也可检测其表达,bcl-2 mRNA吸光度在结扎14d达高峰,为0.56±0.21,且与结扎7、21d相比,两者差异有显著性(P<0.05);100μmol·L^(-1)的GCDC作用正常大鼠肝细胞后,凋亡明显增加,凋亡率为34.9±2.9％;

甘氨鹅脱氧胆酸钠对肝癌SMMC7721细胞凋亡诱导的影响

目的探讨甘氨鹅脱氧胆酸（glycochenodeoxycholic cacid，OCDCA）对人肝癌细胞SMMC7721增殖以及细胞凋亡的影响。方法采用96孔细胞培养板体外培养人肝癌细胞株SMMC7721，GCDCA分别处理细胞24，48，72h，进行MTT实验，计算肝癌细胞的生长抑制率；采用流式细胞仪检测GCDCA对SMMC7721细胞凋亡的影响。结果不同浓度的GCDCA对肝癌细胞SMMC7721均有一定程度的生长抑制作用，高浓度的GCDCA（300μmol／L）处理组对SMMC7721细胞有较强的毒性损伤。低浓度的GCDCA（200μmol／L）处理组能明显诱导细胞凋亡，凋亡率随处理时问的延长而增加。结论GCDCA对人肝癌细胞有增殖抑制作用并能诱导SMMC7721细胞凋亡。

果糖在甘氨鹅脱氧胆酸钠致体外培养大鼠肝细胞凋亡中的保护作用

为探索阻塞性黄疸肝损害的机制及果糖的保护作用 ,采用胶原酶原位肝灌注法获取大鼠肝细胞 ,行原代培养 ,以不同浓度甘氨鹅脱氧胆酸钠 (GCDC)作用肝细胞 2 4h后 ,用 FCM法分析肝细胞的凋亡比率 ,用 TUNEL 技术进行肝细胞凋亡的原位检测 ;用不同浓度果糖 (Fructose)作用于肝细胞 ,10 0 μmol/ L 的 GCDC作用后行 FCM及 TUNEL检测。结果显示 GCDC可致肝细胞凋亡 ,且随 GCDC浓度的增加肝细胞的凋亡比率明显增加。经果糖作用后 ,10 0 μmol/L 的 GCDC致肝细胞的凋亡率明显减少 ,且随果糖作用浓度的增加肝细胞凋亡率减少。提示胆盐致肝细胞凋亡 ,可能是阻塞性黄疸肝损害的机制 ;果糖在 GCDC致大鼠肝细胞凋亡中起保护作用。

从猪胆汁中提取鹅脱氧胆酸的探索

本文探索了一种从猪胆汁中提取鹅脱氧胆酸的方法,为扩大鹅脱氧胆酸的来源开辟了一条新的途径。

鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200对肝肿瘤细胞株凋亡及增殖的影响

目的探讨鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200诱导肝肿瘤细胞株凋亡及抑制增殖的作用及机制。方法分别用40、60及80μM的HS-1200作用于肝肿瘤细胞株BEL7402,于作用后12、24及36 h采用MTT检测细胞活性,流式细胞术、DNA梯状条带、荧光显微镜检测细胞凋亡,Western-blot法检测bcl-2、bax、细胞色素C及caspase-3的表达。结果HS-1200可有效地抑制BEL7402生长,其作用随药物浓度提高和作用时间延长而增强,呈一定的剂量、时间依赖性;FCM结果表明,随作用浓度和作用时间延长,凋亡率显著增加,有显著性差异(P<0.05);Ho-echst33258染色结果显示细胞呈凋亡形态学改变,凝胶电泳显示典型的凋亡梯形条带,Western blot结果显示为HS-1200可提升bax、细胞色素C及caspase-3的表达,降低bcl-2的蛋白表达水平。结论HS-1200对BEL7402有显著的抑制增殖及诱导凋亡的作用,其机理可能为提升bax、细胞色素C及caspase-3的表达,降低bcl-2的表达;HS-1200可能是一种有效的治疗肝癌的化疗药物。

鹅脱氧胆酸(CDCA)在巨噬细胞中增加细胞间黏附分子-1的表达

目的通过检测鹅脱氧胆酸(CDCA)刺激下,小鼠巨噬细胞中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达变化,探讨胆汁酸对巨噬细胞中相关炎性反应分子表达的影响。方法采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及Western blot测定在不同浓度CDCA刺激下,小鼠巨噬细胞株RAW264.7中ICAM-1的mRNA和蛋白水平的变化情况。结果同对照组相比,在CDCA浓度为25、50μmol/L的刺激下,ICAM-1的mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05),两者的表达变化趋势较一致。结论在CDCA的刺激下,小鼠巨噬细胞中ICAM-1的表达明显增加,对于CDCA作为药物在临床上使用的作用研究方面具有重要意义。

甘氨鹅脱氧胆酸诱导肺泡上皮细胞 A549自噬信号改变的实验研究

目的：探讨自噬/溶酶体凋亡信号在甘氨鹅脱氧胆酸（GCDC）处理的肺泡 II 型上皮细胞（AECII）中的变化及作用。方法甘氨鹅脱氧酶处理肺泡上皮 A549细胞后，检测自噬途径的标志蛋白LC3II浓度、细胞内钙浓度及溶酶体酶PH值。结果甘氨鹅脱氧胆酸抑制A549自噬启动蛋白LC3II的表达、增加A549胞内Ca2＋浓度、降低溶酶体功能。结论甘氨鹅脱氧胆酸会影响肺泡上皮细胞自噬相关蛋白表达，损伤溶酶体活性和通透性，可能导致细胞凋亡。

胆汁酸根电极研制——Ⅱ鹅脱氧胆酸根电极的研制

在比较了多种碱性染料后选乙基紫制成了乙基紫——鹅脱氧胆酸溶于辛醇的液膜电极和该活性物与季铵——胆酸按3∶1混合制成的混合液膜电极。前者在1×10^(-4)—5×10^(-3)mol·L^(-1)间对鹅脱氧胆酸根有Nernst响应,后者线性下限可扩展到3×10^(-5)mol·.L^(-1)。灵敏度有这样高的同类电极尚无报导.电极对脱氧胆酸根、甘氨鹅脱氧胆酸根等胆汁酸根也有响应,亦可单独测量之。将电极应用于ca^(2+)与鹅脱氧胆酸结合情况的测定及胆汁酸盐CMC的测量等方面,获得了一定的成功,但电极的PVC化试验结果不理想.

甘氨鹅脱氧胆酸钠通过MAPK/ERK1/2介导Bcl-2在Ser70位点的磷酸化引起人肝细胞癌的抗药

B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)是一种重要的抗凋亡蛋白质,在多种人类肿瘤中普遍过表达。甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDA)与消化道肿瘤的发生发展密切相关,并能介导肝癌细胞对化疗药物的抵抗。本文旨在探讨在GCDA介导的人肝细胞癌(HCC)耐药性中Bcl-2的作用及其机制。本研究以肝癌细胞系为研究对象,Western印迹结果显示,Bcl-2在多种肝癌细胞系中均有表达。设计靶向Bcl-2的siRNA沉默HCC细胞系内源性Bcl-2的表达,发现Bcl-2沉默之后促进了化疗药物5-FU介导的HCC细胞凋亡。机制上,GCDA可介导Bcl-2在Ser70位点的磷酸化,而Ser70位点的磷酸化能够被PD98059(MAPK/ERK1/2抑制剂)所抑制。构建huBcl2-WT和huBcl2-S70A真核表达载体,脂质体转染HCC细胞系。用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡细胞。结果显示,huBcl2-WT过表达能抑制5-FU介导的凋亡,S70位点失活突变成A后,Bcl-2的过表达不能抑制5-FU介导的凋亡。本研究提示,GCDA通过MAPK/ERK1/2通路介导的Bcl-2 Ser70位点的磷酸化,在肝癌细胞的存活和抗药中发挥重要作用。抑制Bcl-2能够促进化疗药物5-FU介导的HCC细胞凋亡,该结果为治疗GCDA介导的耐药性肝癌提供新的思路。

一氧化氮抑制甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的实验研究

目的探讨一氧化氮对甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法成功建立胆甘氨鹅脱氧酸诱导A549细胞凋亡模型后,检测一氧化氮合酶的表达水平及一氧化氮供体对甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的抑制作用。结果甘氨鹅脱氧胆酸可诱导A549细胞发生caspase-3依赖的细胞凋亡,凋亡过程中伴随有一氧化氮合酶表达抑制,一氧化氮供体能有效地减弱胆酸诱导的A549细胞凋亡。结论通过吸入一氧化氮可有效抑制甘氨鹅脱氧胆酸诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。

胆汁淤积性微环境中甘氨鹅脱氧胆酸钠促进肝脏干细胞凋亡

目的探讨在胆汁淤积性肝硬化病理微环境下对肝脏干细胞存活率的影响及体外甘氨鹅脱氧胆酸钠(GCDC)对肝脏干细胞凋亡的影响。方法以Balb/c小鼠胆总管结扎模型模拟胆汁淤积性肝硬化的病理环境并回输肝脏干细胞HP14-19,检测细胞定植存活情况;通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)、结晶紫染色检测甘氨鹅脱氧胆酸钠对增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,通过Western blotting检测凋亡标志物Bax、Bcl-2、Caspase-3表达和磷酸化腺嘌呤核苷二磷酸依赖性蛋白激酶α(p-AMPKα)、腺嘌呤核苷二磷酸依赖性蛋白激酶α(AMPKα)等的表达。结果通过CCK-8检测和结晶紫染色发现,随着甘氨鹅脱氧胆酸钠作用浓度的增加,HP14-19细胞的增殖抑制;流式细胞术提示,GCDC处理组细胞凋亡率明显增加(P<0. 05);Western blotting检测发现,与对照组相比,实验组凋亡基因Bax、Caspase-3蛋白表达上调,抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达下调,AMPKα活化增加(P<0. 05)。结论胆汁淤积性肝硬化所导致的胆汁淤积微环境诱导肝脏干细胞发生凋亡。

慢性主动脉周围炎患者临床特征分析及鹅脱氧胆酸在其发病机制中的临床意义

目的分析慢性主动脉周围炎(chronic periaortitis,CP)患者的临床特征,初步探索鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)在CP发病机制中的意义,为治疗该病提供新思路。方法回顾性分析2004年10月至2017年3月期间17例CP患者的临床资料。液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测5例CP患者及各对照组患者血清中CDCA含量。此外,对1例活动期CP患者进行后腹膜穿刺,病理标本行免疫组化检测IL-6、巨噬细胞表面特异性标志物F4/80及法尼酯受体(farnesoid-X-receptor,FXR)表达情况。结果 17例CP患者中,男女比例为3.25∶1,平均年龄为(62.5±8.4)岁。患者的首发症状有腰痛、腹痛等。实验室检查可有血沉和C反应蛋白的升高。与各对照组患者相比,CP患者血清中CDCA含量明显降低。免疫组化结果显示,脂肪和胶原纤维组织内泡沫细胞样细胞和淋巴细胞聚集部位可见IL-6高表达,并有F4/80及FXR的表达。结论 CP是一种罕见的自身免疫性炎症性疾病,起病隐匿,临床特征各异。血清中CDCA降低可能是该疾病的新临床指标。CDCA-FXR/IL-6通路可能在CP发病中起到一定作用。

甘氨鹅脱氧胆酸对体外细粒棘球蚴原头节活力及ROS影响

目的研究甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid,GCDCA)对体外细粒棘球蚴原头节活力及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的影响。方法将细粒棘球蚴原头节分为对照组及GCDCA处理组(500、1 500、2 500μmol/L),应用体外培养技术,通过伊红染色法每天定时在光学显微镜下观察原头节的活力并记录存活和死亡数目。使用试剂盒检测不同浓度GCDCA处理24h后各组原头节体内caspase-3酶活性变化;DCFH-DA染色法荧光显微镜观察GCDCA作用24h后原头节内ROS水平变化。结果 500、1 500、2 500μmol/L GCDCA处理后均可导致原头节活力减弱,且最高浓度组在第7d时原头节全部死亡。500、1 500、2 500μmol/L GCDCA组作用原头节24h后caspase-3酶活性与对照组相比明显升高(F=555.162,P<0.05)。500、1 500、2 500μmol/L GCDCA作用原头节24h后原头节内ROS水平与对照组相比明显升高(F=216.901,P<0.05)。结论 GCDCA能抑制体外原头节生长,促使原头节死亡,可能与活化caspase-3及提高原头节内ROS水平相关,具体机制有待进一步研究。

血清总胆汁酸水平、胆酸/鹅脱氧胆酸比值检测在乙型肝炎患者中的诊治价值

目的:探究和评价血清总胆汁酸水平、胆酸/鹅脱氧胆酸比值检测在乙肝患者中的诊治价值。方法:选取96例确诊的乙型肝炎患者,另选择体检身体健康的96例健康人作为试验的对照,检测所有研究对象的血清总胆汁酸(TBA)、胆酸/鹅脱氧胆酸比值以及肝功能。结果:观察组患者的TBA、胆酸鹅脱氧胆酸比值分别为(69.14±22.15)μmol/L,(0.77±1.20)与对照组健康人相比,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者ALT、AST水平分别为(89.65±25.36)IU/L、(99.14±42.21)IU/L,与对照组相比其差异较为明显,有统计学意义(P<0.05)。结论:血清总胆汁酸与胆酸鹅脱氧胆酸比值在乙型肝炎患者的诊断中有较为敏感的变化,对其有较好的诊断意义,值得临床推广。

鹅脱氧胆酸诱导细粒棘球蚴原头节凋亡作用机制的初步研究

目的初步探究鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)诱导细粒棘球蚴原头节凋亡的作用机制。方法采用鹅脱氧胆酸体外处理细粒棘球蚴原头节,0.1%伊红染色,倒置显微镜观察原头节的活力;Caspase-3试剂盒检测其酶活性变化;采用DCFH-DA染色法利用荧光酶标仪检测鹅脱氧胆酸作用2、4 d后原头节内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的荧光强度的变化;western blot技术检测Nrf2蛋白的表达;生物化学法测定细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase,TPx)酶活性的变化。结果体外应用500、1000、2000、3000μmol/L鹅脱氧胆酸能够抑制原头节体外生长,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强;不同浓度鹅脱氧胆酸作用原头节24、48 h后caspase-3酶活性升高,随着时间的延长caspase-3酶活性增加越明显;不同浓度鹅脱氧胆酸作用原头节2、4 d后观察到原头节内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的水平升高(F=1631.77,P<0.05),同时western blot检测发现Nrf2蛋白的表达降低(P<0.05),并检测到抗氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶(F=756.033,P<0.05)和硫氧还蛋白过氧化物酶(F=608.848,P<0.05)的活性降低。结论鹅脱氧胆酸诱导细粒棘球蚴原头节凋亡可能是通过氧化应激途径起作用。