超高效液相色谱-串联质谱法快速测定蘑菇中5种鹅膏肽类毒素

目的建立超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)快速测定鲜蘑菇中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽5种强毒性鹅膏肽类毒素的检测方法。方法样品经充分粉碎后,加入10%甲醇超声提取后,离心上清液过0.22μm微孔滤膜,用Waters Xselect CSH C_(18)(2.1 mm×100 mm,1.7µm)色谱柱分离,外标法定量。结果在优化条件下,该方法中5种强毒性鹅膏肽类毒素的最低检出限均为0.02 mg/kg,定量限为0.06 mg/kg,平均回收率为78.2%~103.5%,相对标准偏差为3.1%~7.6%。结论本方法简便、快速、准确,回收率好,适用于因鹅膏肽类毒素引起的食物中毒快速应急检测。

UPLC-MS/MS法测定蘑菇、科研用人血清和尿液中5种鹅膏肽类毒素的方法研究

本文建立了适用于蘑菇、科研用人血清和尿液样本中5种鹅膏肽类毒素的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。样品经乙腈提取和水稀释后,采用XSelect HSS T3(3mm×150mm,2.5μm)进行色谱分离,以0.01%甲酸-乙腈和水为流动相进行梯度洗脱,串联质谱-电喷雾离子源(ESI)正离子模式检测。5种鹅膏肽类毒素在1~50ng/mL范围内呈现良好线性关系,相关系数均大于0.99,蘑菇样品方法检出限为0.06 mg/kg,定量限为0.2 mg/kg,在3个加标水平下平均回收率为92.6%~124.0%,相对标准偏差为3.2%~14.8%(n=6);科研用人血清样品方法检出限为0.01 mg/L,定量限为0.03 mg/L,在3个加标水平下平均回收率为85.5%~123.5%,相对标准偏差为0.9%~16.4%(n=6);科研用人尿液样品方法检出限为0.005 mg/L,定量限为0.015 mg/L,在3个加标水平下平均回收率为84.8%~119.3%,相对标准偏差为0.9%~16.1%(n=6)。本方法简单快速,高效准确,适用于蘑菇、科研用人血清和尿液中5种鹅膏肽类毒素的快速检测,为突发事件应急检验提供参考依据。

固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定血清和尿液中5种鹅膏肽类毒素

建立了适用于人体血清和尿液样本中5种鹅膏肽类毒素的固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱(Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,SPE-UPLC-MS/MS)分析方法。血清样品加水稀释提取、尿液样品进行离心,两者经HLB固相萃取净化后,采用XSelect HSS T3(150 mm×3 mm,2.5μm)进行色谱分离,水和0.01%甲酸-乙腈的流动相组合进行梯度洗脱,三重四极杆串联质谱正离子模式进行检测。结果表明,5种鹅膏肽类毒素在1~100 ng·mL^(-1)线性关系好,相关系数均大于0.997,血清样品方法定量限为1.5 ng·mL^(-1),在3个加标水平下平均回收率为74.9%~114.2%,相对标准偏差为3.1%~17.1%(n=6);尿液样品方法定量限为1.0 ng·mL^(-1),在3个加标水平下平均回收率为81.8%~104.5%,相对标准偏差为1.2%~12.5%(n=6)。本方法简便高效,适用于快速检测突发应急事件中毒患者的血清和尿液中鹅膏肽类毒素。

TurboFlow在线净化-液相色谱-串联质谱法快速检测人尿中鹅膏肽类毒素

鹅膏肽类毒素是一类环状多肽类蘑菇毒素,中毒后会造成急性肝损伤,病死率非常高。我国因误食野生毒蘑菇导致的中毒事件常有发生,测定人尿中鹅膏肽类毒素的浓度,可为临床早期诊断和救治提供有价值的信息。该研究建立了TurboFlow(TF)在线净化-液相色谱-三重四极杆质谱快速定量检测尿液中5种鹅膏肽类毒素(α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽和二羟鬼笔毒肽)的新方法。尿液样品经高速离心后,直接注入TurboFlow在线净化-液相色谱-串联质谱进行分析。对影响TF在线净化的参数如TF净化柱、上样溶剂、洗脱溶剂、转移流速、转移时间等进行了优化。在优化后的实验条件下,以TurboFlow TM Cyclone柱(50 mm×0.5 mm)为净化柱,Hypersil GOLD C 18柱(100 mm×2.1 mm)为分析柱,甲醇和4 mmol/L乙酸铵为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子选择反应监测(SRM)模式下进行检测,基质匹配外标法定量。结果表明,鹅膏肽类毒素在1.0~50.0μg/L范围内呈现良好的线性关系,相关系数均可达到0.997以上。方法的检出限为0.15~0.3μg/L,定量限为0.5~1.0μg/L。在2.0、5.0和10.0μg/L的加标水平下,5种鹅膏肽类毒素的日内和日间回收率分别为87.0%~108.6%和86.8%~112.7%,日内、日间相对标准偏差(RSD)均小于14.5%。该检测方法准确、快速、灵敏度高、易操作,适用于公共卫生应急检测或临床中毒病因识别检测。

毒鹅膏菌和鹅膏肽类毒素研究进展

在我国,经常有因为误食剧毒鹅膏菌而导致中毒的报道。本章概述了鹅膏肽类毒素的化学结构与性质、中毒的症状和机理、我国产鹅膏肽类毒素的主要蘑菇种类等,为预防鹅膏菌中毒和其应用研究提供一定的科学依据。

超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱指纹图谱检测毒蕈中4种鹅膏肽类毒素

建立了基于超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC-ESI-Q-TOF)的4种鹅膏肽类毒素特征信息的色谱和质谱指纹图谱和分析鉴定方法。样品用含0.1%TFA的甲醇溶液提取后,再用Oasis HLB固相柱净化,洗脱液经UPLC HSS T3色谱柱分离后,采用ESI-TOF MS和ESI-Q-TOF MS2进行测定;建立了包含毒素准分子离子准确质量数及其同位素特征,以及二级质谱特征子离子信息的指纹图谱;方法定量测定的线性范围在50～1000μg/L,相关系数在0.9974～0.9985之间;4种毒素的检出限均为10μg/L;定量限为50μg/L;加标回收率在68.2%～88.2%之间;相对标准偏差为7.2%～11.8%。对采集的20余种野生菌样品进行分析,有5种样品检测出含有毒素。本方法快速、准确、选择性好、特异性强,适用于突发毒蕈中毒事件样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽的确证分析。

鹅膏肽类毒素检测方法的历史与现状

每年因误食毒蘑菇导致中毒死亡事件在世界各国都有发生,也是我国食物中毒事件中导致死亡的重要因素之一。鹅膏菌属中某些种类含有的肽类毒素是主要的致死原因,快速而有效地检测样品(包括有毒蘑菇子实体、食物剩余物、呕吐物、中毒患者血液和尿液等)中的毒素对于食物中毒的毒源鉴定和中毒后的针对性治疗具有重要意义。本文从化学显色反应、生物化学法、物理法、色谱法等4个方面对鹅膏肽类毒素检测方法的历史和研究进展进行整理和总结,并对其在我国的应用加以讨论和展望。

QuEChERS-液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素

建立了5种鹅膏肽类毒素的液相色谱-四极杆飞行时间质谱快速分析方法。样品用乙腈提取,经C;和无水硫酸钠净化,用水稀释后,四极杆飞行时间质谱电喷雾正离子模式检测。结果表明,5种鹅膏肽类毒素在10~200 ng/mL的范围内均呈良好的线性关系,相关系数均>0.99,方法检出限为0.03~0.36 mg/kg,平均回收率为90.1%~105.4%,相对标准偏差为0.1%~4.1%。该方法快速简便、回收率高,适用于毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素的定性定量分析。

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速测定野生蘑菇中6种鹅膏肽类毒素

建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱快速测定野生蘑菇中6种鹅膏肽类毒素的分析方法。样品采用甲醇-水(V/V=50/50)提取和水稀释后,采用ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)进行分离,以0.1%乙酸-乙腈和水为流动相进行梯度洗脱,四极杆飞行时间质谱电喷雾正离子模式检测。6种鹅膏肽类毒素在5~100 ng·mL^(-1)均呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.995,方法检出限为0.4 mg·kg^(-1),定量限为1 mg·kg^(-1)。在3个加标水平下平均回收率为74.1%~119.9%,相对标准偏差为0.1%~6.7%(n=6)。本方法快速准确,适合于野生蘑菇中6种鹅膏肽类毒素的快速检测。

含鹅膏肽类毒素蘑菇中毒药物治疗研究进展

90%以上的蘑菇中毒死亡事件是由含鹅膏肽类毒素蘑菇所致,目前该类蘑菇中毒尚无特效解毒药物。本文根据不同作用机制,将治疗药物分为胃肠道吸收抑制剂、肝细胞摄取抑制剂、抗氧化剂、RNAPⅡ结合抑制剂及中药5类,并对其作用机制、临床适应证、给药剂量进行综述,以期为临床治疗提供指导。

高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定深圳梧桐山野生蘑菇中5种鹅膏肽类毒素的含量

针对深圳梧桐山野生蘑菇中毒案件,于事发地采集23种野生蘑菇样品,采用题示方法同时测定其中α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA)、羧基二羟鬼笔毒肽(PCD)、羧基三羟鬼笔毒肽(PSC)和二羟鬼笔毒肽(PHD)等5种鹅膏肽类毒素的含量,并对唯一检出毒素的致命鹅膏不同生长时期的子实体中的5种毒素含量进行考察。在新鲜蘑菇1 g或干蘑菇0.2 g中加入10 mL水,匀浆后超声10 min,离心5 min。分取1 mL上清液过0.22μm水相滤膜,滤液供高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法分析。以ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱为固定相,以不同体积比5 mmol·L^(-1)乙酸铵溶液和乙腈的混合溶液为流动相进行梯度洗脱,分离后的各目标物用串联质谱仪的电喷雾离子源正离子模式电离,多反应监测模式检测。结果显示:5种鹅膏肽类毒素的质量浓度均在20.0~500.0μg·L^(-1)内与其对应的峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)均为6 ng·g^(-1);对空白样品进行加标回收试验,回收率为78.3%~98.3%,测定值的相对标准偏差(n=6)为0.30%~11%。在23种野生蘑菇中,除致命鹅膏外,其他22种野生蘑菇均未检出5种鹅膏肽类毒素。致命鹅膏样品中检出了α-AMA、β-AMA、PCD和PSC,毒素总量在成熟期最高(1.50 mg·g^(-1),湿重),生长期最低(1.05 mg·g^(-1),湿重);β-AMA检出量最高、α-AMA次之。

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素

鹅膏肽类毒素是毒蘑菇中毒事件中最常见的致死毒素,因此研究建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测毒蘑菇中5种鹅膏肽类毒素的方法。样品经纯水提取后,以乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,用HSS T3色谱柱(100 mm×2.0 mm, 2.1μm)对待测组分进行色谱分离;采用可加热电喷雾电离源(HESI),全扫描/数据依赖二级质谱扫描(Full mass-ddMS^(2))模式对待测物进行定性分析;在目标离子选择性扫描(Targeted-SIM)模式下,以外标法对待测物进行定量测定。结果显示,5种鹅膏肽类毒素在1.0~20.0μg/L范围内均呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99,检出限均为0.006 mg/kg,加标回收率为81.8%~102.4%,相对标准偏差为3.2%~8.3%。方法提供了丰富的化合物特征信息,可根据提取离子流色谱图结合同位素分布信息锁定可疑化合物,根据一级质谱和二级质谱碎片离子的精确质荷比,在没有相关标准品的情况下可对未知化合物进行结构推断和确证。方法样品前处理简单,定性分析特异性强,定量测定灵敏度高,可满足突发公共卫生事件快速定性定量的检测要求,同时也为开展此类毒素中毒快速筛查及未知毒素的结构锁定提供了可靠的技术支撑。

高效液相色谱⁃串联质谱法测定野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素

蘑菇毒素种类繁多,化学结构差异大,为了实现蘑菇中毒素的准确、高通量分析,本文采用固相萃取净化技术,以高效液相色谱⁃串联质谱法(HPLC⁃MS/MS)为分析手段,建立了蘑菇中5种鹅膏肽类、2种色胺类蘑菇毒素的分析方法。优化了色谱条件、质谱参数和样品提取净化方法,蘑菇干粉以含0.3%甲酸的甲醇提取,强阳离子交换柱(SCX)净化后,待测样液用T3色谱柱分离,以含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用多反应监测模式(MRM)扫描,以基质匹配标准曲线法对鹅膏肽毒素定量,以同位素内标法对色胺类毒素定量。结果显示,7种毒素在一定的浓度范围内与峰面积(或峰面积比)均呈良好的线性关系(r^(2)>0.99)。蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素、鹅膏肽类毒素的检出限(LOD)分别为2.0、5.0、10μg/kg,定量限(LOQ)分别为5.0、10、20μg/kg;以香菇干粉为基质,在3个水平下加标,5种鹅膏肽类毒素的回收率为71.8%~115%,相对标准偏差(RSD)为2.14%~9.92%;2种色胺类毒素的回收率为80.6%~117%,RSD为1.73%~5.98%;与国家市场监管总局食品补充检验方法BJS 202008进行比对,结果表明鹅膏毒素含量具有可比性,无显著性差异(p>0.05)。该方法简便、快速,准确度和精密度较高,符合要求,适用于野生蘑菇中7种蘑菇毒素的检测。采用该法开展了福建省野生蘑菇中蘑菇毒素分布情况的调查,在全省9个设区市采集了59份野生蘑菇样品,采用核糖体DNA内转录间隔区(rDNA⁃ITS)分子条形码技术进行了种属鉴定,在2份样品中检测出了蘑菇毒素,在1份拟灰花纹鹅膏(Amanita fuligine⁃oides)干粉提取物中检出α⁃鹅膏毒肽、β⁃鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,含量分别为607、377、69.0 mg/kg;在1份口蘑科(Tricholomataceae)蘑菇中检出脱磷裸盖菇素,含量为12.6 mg/kg。

超高效液相色谱-串联质谱法测定野生蘑菇中的6种鹅膏肽类毒素

目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)测定野生蘑菇中6种鹅膏肽类毒素的含量。方法 干燥后的样品粉末经水提取后,提取液转移至固相萃取柱净化,采用ACQUITY UPLC BEH C_18色谱柱以5 mmol/L的甲酸铵水溶液和甲醇为流动相迚行梯度洗脱,流速为0.3mL/min,柱温40℃,采用多反应监测模式检测。结果 6种待测物在色谱图上全部做到基线分离,在20～1000μg/kg的范围内呈现良好的线性关系,检出限均达到20μg/kg,不同水平下的加标回收实验中各待测物的平均回收率为78.2%～95.7%,相对标准偏差为1.2%～5.2%。结论 该方法操作简单,灵敏度高,重复性好,适用于野生蘑菇中鹅膏肽类毒素的检测。

磁性固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱同时测定尿液中6种鹅膏肽类毒素

目的建立磁性纳米材料萃取净化结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定尿液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基三羟鬼笔毒肽的检测方法。方法尿液样本经C18功能化磁性纳米颗粒(Fe3O_(4)@SiO_(2)@C18)的萃取净化,采用超高效液相色谱-串联质谱电喷雾电离(ESI),多反应监测(MRM)模式测定6种鹅膏肽类毒素。结果6种鹅膏肽类毒素的线性范围为0.50~50.00 ng/ml,均呈良好的线性关系;检出限为0.05~0.15μg/kg,定量限为0.15~0.50μg/kg,平均加标回收率为83.5%~102.3%之间,相对标准偏差(RSD)为2.55%~5.67%。结论该方法简便快速,结果准确可靠,适用于尿液中6种鹅膏肽类毒素检测。

云南楚雄3种环柄菇中鹅膏肽类毒素的检测与分析

目的对云南楚雄地区3种环柄菇中的6种鹅膏肽类毒素含量进行分析。方法采集的蘑菇45℃烤干,采用形态学和分子生物学方法进行物种鉴定。将蘑菇分为3个不同生长时期(生长期、成熟期、衰老期)和不同组织部位(菌盖、菌柄、整体),用超纯水超声提取毒素,采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法、电喷雾(ESI-)模式下多反应监测(MRM)方式检测,外标法定量。结果细环柄菇(Lepiota clypeolaria)和冠状环柄菇(Lepiota cristata)未检出鹅膏肽类毒素,肉褐鳞环柄菇(Lepiota brunneoincarnata)中检测出α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA),其中α-AMA含量高于β-AMA。α-AMA总含量成熟期(1.67 mg/g)>生长期(1.56 mg/g)>衰老期(0.40 mg/g),β-AMA总含量成熟期(0.71 mg/g)>生长期(0.60 mg/g)>衰老期(0.14 mg/g)。两种毒素在生长期和成熟期的分布为:菌盖>菌柄,而衰老期为菌柄>菌盖。结论楚雄地区的肉褐鳞环柄菇L.brunneoincarnata主要含有鹅膏毒肽,包括α-AMA、β-AMA、Amanin、Amaninamide,不含鬼笔毒肽及毒伞肽,并且在不同生长期、不同组织部位中的α-AMA、β-AMA含量具有差异,能够为该类蘑菇中毒的临床诊断及治疗提供参考。

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速检测菌类中鹅膏毒肽毒素

采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定蘑菇中3种鹅膏肽类毒素的含量[α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA)和γ-鹅膏毒肽(γ-AMA)]。将样品均质后,利用甲酸-甲醇-水(0.5∶10∶89.5,v/v/v)标准混合溶液提取,经由BEH shield RP18柱(150 mm×2.1 mm,1.7μm)实施分离,采取梯度洗脱,流动相为0.03%氨水与甲醇,在HESI离子化方式下以tSIM正离子模式进行扫描检测,外标法定量。蘑菇所含3类鹅膏肽类毒素具良好线性关系,区间是0.05 mg/kg~5 mg/kg,相关系数r均在0.995以上,确定α-AMA、γ-AMA检出限是0.01 mg/kg,定量限是0.02 mg/kg;β-AMA的检出限和定量限分别为0.02 mg/kg和0.05 mg/kg。平均回收率于3个加标水平下处在72.5%~91.9%范围,相对标准偏差(RSD,n=6)为2.8%~7.4%。方法简单高效,适用于蘑菇中3种鹅膏肽类毒素(α-AMA、β-AMA和γ-AMA)的快速检测。

含鹅膏毒肽蘑菇中毒免疫毒性研究进展

蘑菇中毒是我国食物中毒事件中导致死亡的最主要因素,由鹅膏菌属引发的案例占总致命性毒蕈中毒案例的95%,含鹅膏毒肽(AMA)蘑菇中毒死亡人数在我国占蘑菇中毒总死亡人数的90%。1996年发现小剂量AMA可刺激巨噬细胞增多产生TNF;2001年发现其可活化T淋巴细胞产生TNF-α;含AMA蘑菇中毒导致肝损害与其氧化应激及炎症诱导的免疫毒性有关,AMA活化免疫刺激产生免疫毒性导致机体免疫失衡,进一步加重炎症,恶性循环加重靶器官损伤。研究含AMA蘑菇中毒的免疫毒性,有助于开发有效的治疗方法,减轻患者的痛苦,提高患者的存活率。

鹅膏肽类毒素的研究进展

本文在阅读国内外鹅膏肽类毒素相关文献的基础上，从鹅膏肽类毒素的种类、来源、毒性及毒作用机制、中毒表现及治疗方面做出归纳整理，以期为今后鹅膏肽类毒素的进一步研究提供一定帮助。

鹅膏肽类毒素质谱检测方法的研究进展

概述了鹅膏肽类毒素质谱检测方法的研究进展。重点介绍了适用于鹅膏肽类毒素的各种质谱检测方法,主要包括液相色谱质谱、毛细管电泳质谱和超高效液相色谱质谱等方法。