北京市及周边省份家禽鹦鹉热嗜性衣原体流行状况的调查

对北京市周边6省份怀疑感染鹦鹉热嗜性衣原体的鸡鸭血清样品374份、病料81份,分别使用IHA诊断试剂盒、ELISA试剂盒以及抗酸染色试剂和荧光抗体诊断试剂进行了检查,以评价北京市及其周边地区家禽鹦鹉热嗜性衣原体的流行性。结果,上述4种试剂检测出的阳性率依次为24.9%、77.9%、18.5%和38.2%;北京市10份SPF鸡血清的抗体全部为阳性;患病肉鸡、肉鸭气囊样品,蛋鸡输卵管样品的检出率较高。表明,北京市及其周边地区家禽已经感染了鹦鹉热嗜性衣原体,酶联免疫吸附法和荧光抗体染色法能分别提高抗体和抗原的检出率。

鹦鹉热嗜性衣原体特异性TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立一种特异、灵敏、重复性好的鹦鹉热嗜性衣原体的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。方法利用鹦鹉热嗜性衣原体MOMP基因的特异保守序列设计引物和MGB探针,通过优化,获得最佳反应体系与反应条件,同时进行特异性、重复性、灵敏性评价与Spike-test实验进行临床应用性评价,利用该检测方法对禽鸟类粪便样品进行检测,并与常规PCR检测方法进行比较。结果该方法在0.01pg^100pg范围内线性相关系数为0.999,扩增效率为97.7%;对鹦鹉热嗜性衣原体菌株检测结果均呈现阳性,而非鹦鹉热嗜性衣原体菌株及其它衣原体菌株为阴性;重复性试验中,变异系数为0.317%~0.563%;检测灵敏性为0.01pg;Spike-test试验中最低检出量为25个EB;该方法对禽鸟类粪便样品的检出率为14.3%(40/282),高于常规PCR检测法的7.4%(21/282)。结论本文所建立的Taqman-MGB荧光定量PCR检测法是一种灵敏、高效、稳定,可在嗜性衣原体属中准确检测鹦鹉热嗜性衣原体的方法,该方法的建立更有意于今后对禽鸟类实施鹦鹉热的临床诊断与分子流行病学研究。

鹦鹉热嗜性衣原体感染SPF鸡和污染相关疫苗的初步调查

为初步调查SPF鸡感染鹦鹉热嗜性衣原体状况及相关SPF鸡胚源疫苗是否出现污染,本试验通过采集不同日龄的SPF鸡血清70份、SPF种蛋卵黄膜30份,收集市场上销售的SPF鸡胚源疫苗共41支,利用国产间接血凝试剂盒检测抗体,进口免疫荧光试剂盒分别测定其抗体、抗原阳性率,以评价SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体的流行状况和相关疫苗的污染状况。本试验结果显示,SPF鸡血清阳性率分别为31.4%(荧光法)、5.7%(间接血凝法);SPF种蛋阳性率33.3%,SPF鸡胚源疫苗平均阳性率31.7%。SPF鸡已经感染了鹦鹉热嗜性衣原体,且发现经鸡胚卵黄膜而传播病原的新途径,进而造成SPF鸡胚源疫苗出现衣原体污染。因此,加强SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体监测已势在必行。

三种方法对禽鹦鹉热嗜性衣原体疑似病例病原的流行调查

目的利用免疫荧光抗体法、PCE-ELISA、PCR法分别检测北京市及周边地区禽鹦鹉热嗜性衣原体疑似病例的病原,以了解和评价该病原流行状况。方法收集临床疑似禽衣原体的父母代、商品代家禽、SPF鸡喉头拭子、气囊组织、子宫黏膜,组织标本固定后采用直接免疫荧光染色测定衣原体包含体;喉头拭子、子宫黏膜处理后以PCE-ELISA定量测定衣原体;以衣原体保守性高的序列设计CTU/CTL引物扩增病料组织的omp-1基因片段。结果直接荧光染色法显示家禽衣原体平均阳性率为38.7%,组织检出率依次为子宫黏膜、气囊、喉头拭子;PCE-ELISA检测显示平均阳性率为58.7%,其中SPF鸡阳性率为10.0%,健康肉鸡达到30.0%;PCR法检测家禽衣原体平均阳性率为71.6%,SPF鸡为10.0%。样本的目的基因与标准禽衣原体6BC同源性超过99%。结论种禽场和商品养殖场均发现疑似病例中禽鹦鹉热嗜性衣原体感染情况较为严重。荧光抗体染色、PCE-ELISA可用于临床实践中进行快速、准确检测。

禽鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因N端区的克隆与表达

为探讨禽鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因的生物学功能,本实验根据禽类鹦鹉热嗜性衣原体Cal-10株全基因序列设计引物,用PCR法扩增禽嗜性衣原体PmpD基因N端区,将特异性目的基因片段克隆入PBS-TII载体,经测序后确认为目的基因,并提交GenBank。试验扩增的禽鹦鹉热嗜性衣原体Cal株PmpD基因与禽鹦鹉热衣原体6BC株的PmpD基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与流产衣原体成员嗜流产衣原体S26/3株、嗜豚鼠衣原体(GPIC)、嗜猫衣原体(Fe/C-56)核苷酸相似性分别为89%、82%和77%。PmpD基因N端区基因亚克隆到pET-32a(+)载体上,重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果表达了约63 ku大小的融合蛋白;分别用禽鹦鹉热嗜性衣原体多克隆抗体、猪、羊流产嗜性衣原体多克隆抗体与表达出的重组蛋白进行Western blotting检测,结果表明该蛋白与禽源衣原体多克隆抗体呈阳性反应,与猪、羊源衣原体多克隆抗体呈阴性反应,显示该重组蛋白具有种属特异性。本研究首次表达了禽类鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因的N端区的重组蛋白,为进一步研究其生物学功能提供依据。

舞钢市禽衣原体病流行病学调查

本试验采集了舞钢市8个乡镇的20个养殖场（户）的待检样品进行血清学和分子生物学检测。结果表明：8个乡镇禽衣原体血清阳性率分别为45．54％、42．66％、35．22％、30．23％、41．80％、26．12％、26．34％和38．92％；分子生物学检查共检测出阳性数102个，阳性率为12．23％，其中喉头棉拭子样品、精液样品的阳性率分别为12．04％和14．29％，证实鹦鹉热嗜性衣原体已在鸡群中流行，并可通过种蛋垂直传播。

天津地区禽衣原体病流行病学调查

鉴于天津地区禽衣原体病广泛存在,已经给养禽业带来巨大的经济损失,为摸清天津地区禽衣原体病流行情况,采集了天津市宝坻区、蓟县、宁河区、西青区、武清区、汉沽区、津南区和静海区8个不同地区的20个养殖场(户)的待检样品进行血清学和分子生物学检测。结果表明:8个不同地区禽衣原体血清阳性率分别为45.54%、42.66%、35.22%、30.23%、41.80%、26.12%、26.34%和38.92%,宝坻区、蓟县和武清区饲养量较大,衣原体血清阳性率较高,表明衣原体血清阳性率高低与家禽饲养量密切相关;分子生物学检查共检测出阳性数102个,阳性率为12.23%,其中喉头棉拭子样品、精液样品的阳性率分别为12.04%和14.29%,证实鹦鹉热嗜性衣原体已在鸡群中流行,并可通过种蛋向子代传播。