鹿流行性出血病毒分子生物学研究进展

鹿流行性出血病毒是一种在全世界野生及驯养的有蹄动物中广泛存在的重要病原体。该病毒属呼肠病毒科环状病毒属,有12个血清型,是一种有10个节段(L1-L3、M4-M6、S7-S10)的双链RNA病毒,编码10个蛋白(VP1-7和NS1、NS2、NS3/NS3A)。VP7蛋白具有很强的抗原性且保守性最高。VP2与病毒型特异性有关,可诱导产生中和抗体。VP3为群特异性抗原,高度保守,具有亲水性保守区域。非结构蛋白NS1、NS2和NS3/NS3A及其编码序列均相当保守。该病毒的分子生物学诊断技术主要有PCR和核酸探针杂交技术。

广西首例牛源鹿流行性出血热病毒的分离鉴定

为了解广西反刍动物鹿流行性出血热病毒(EHDV)的感染情况,本研究在广西马山县设立牛羊虫媒病监控点,筛选EHDV抗体阴性的10头牛和5只羊作为哨兵动物,分别混养在EHDV抗体阳性的牛群及羊群中,采取白天放牧,夜间赶回栏舍的方式饲养。采用竞争性ELISA全年监测其抗体转阳情况,取抗体阳转动物的红细胞,接种BHK-21细胞分离EHDV。以RT-PCR、病毒中和试验等对分离株进行鉴定,结果在3头哨兵牛EHDV抗体转阳前后的7份抗凝血中分离到3株病毒,TCID50分别为102.5/0.1 m L、102.83/0.1 m L和102.5/0.1 m L,血清型均为EHDV-5型。该结果为首次在广西牛群中分离到EHDV,表明广西反刍动物存在EHDV感染。本研究为国家监测反刍动物重要虫媒病毒病流行情况和疫病风险分析提供了有价值的参考资料。

鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达

根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。

鹿流行性出血病病毒VP7-ELISA抗体检测方法的建立

以原核表达的鹿流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)VP7蛋白为包被抗原,用HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗,建立了检测EHDV群特异性抗体的间接ELISA方法(VP7-ELISA)。用VP7-ELISA方法检测EHDV阳性血清、其他病毒阳性血清及健康羊血清,结果表明,VP7-ELISA方法具有良好的特异性;用VP7-ELISA和琼脂扩散试验(AGID)检测EHDV阳性血清抗体效价,结果表明,VP7-ELISA的敏感性相当于AGID的8～16倍。用VP7-ELISA和AGID同时检测临床样品188份,VP7-ELISA的特异性和敏感性分别为95.9%和100%,两种方法的符合率为96.3%。表明VP7-ELISA可以代替AGID用于EHDV抗体检测。

鹿流行性出血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了更好的研究鹿流行性出血病病毒(EHDV)的生物学特性和建立EHDV免疫学检测方法,本研究用纯化的EHDV免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,获得了2株(1A5和8H6)能够稳定分泌抗EHDV单抗的杂交瘤细胞株。其细胞培养上清效价分别为1∶256和1∶512,腹水效价分别为1∶1024000和1∶2048000;McAb 1 A5和8H6的相对亲和力分别为0.9mg/L和0.7mg/L。间接ELISA结果显示,2株单抗仅与EHDV反应,不与蓝舌病病毒、赤羽病病毒、水疱性口炎病毒、小反刍兽疫病毒和BHK细胞反应,表明2株单抗特异性良好。这2株单抗的获得为研究EHDV生物学特性和建立EHDV检测方法奠定了基础。

广西鹿流行性出血热病毒血清型调查及分布影响分析

2014年采集广西5市7县7个养殖场313份牛血清,经cELISA检测随机筛选出100份鹿流行性出血热病毒(EHDV)血清强阳性样品(cut-off值>70%)进行微量细胞中和试验,以调查广西EHDV血清型的存在情况,以及分析其地理分布的影响因素,为丰富EHDV流行病学数据,进一步做好EHDV的综合防制提供依据。

鹿流行性出血病病毒可视化RT-LAMP现场检测方法的建立

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)可视化RT-LAMP检测方法。本研究根据EHDV内衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化,建立了EHDV可视化RT-LAMP检测方法。本研究建立的RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该方法检测口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒和4个血清型EHDV的RNA样品,结果显示该方法能检测4个血清型EHDV RNA,与其他病毒RNA无交叉反应,特异性较强;该方法最低可检测到4.7×10^-8ng/μL的RNA,敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍。应用建立的RT-LAMP和普通RT-PCR方法分别对85份牛血液样品进行检测,结果显示,二者阳性和阴性符合率分别为100%和98.8%。本研究建立的EHDV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和高通量检测的优点,为牛EHDV感染提供了快速可视化现场检测方法。

云南省2株鹿流行性出血热病毒的分离鉴定

为了监测云南省反刍动物鹿流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)的感染情况,本试验在云南省师宗县设立了监控点,筛选出EHDV抗体阴性的10头牛和5只羊作为哨兵动物,每年的5～10月份每周采血1次,11月到次年4月份每月采血1次,通过酶联免疫吸附试验监测其抗体转阳情况,用转阳牛的红细胞接种BHK以分离病毒,用病毒RT-PCR和中和试验鉴定病毒。结果显示,从2头转阳牛的抗凝血中分离到2株EHDV,其TCID_(50)分别为10^(-2.5)/0.1 mL和10^(-3.44)/0.1 mL,血清型均为EHDV-5型。本试验在云南省分离到EHDV,明确了云南省反刍动物存在EHDV感染,为我国监控EHDV流行情况及疫病风险防范提供了重要借鉴意义。

蓝舌病病毒和鹿流行性出血热病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时检测蓝舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血热病毒(EHDV)的快速诊断方法,本研究根据BTV和EHDV保守基因序列设计特异性引物和探针,建立了双重荧光定量RT-PCR,对该方法进行反应条件、特异性及敏感性的验证,并用该方法对部分已知临床样品进行检测。结果显示,该方法与口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、小反刍兽疫病毒等牛、羊常见疾病病原无交叉反应;对两种重组质粒标准品的检出极限均为1×10~2copies/L;批内和批间重复试验的变异系数均小于2.55%。临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样品中BTV和EHDV的核酸。结果表明,本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以为BTV和EHDV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。

鹿流行性出血热病毒实时荧光RT-RPA检测方法的建立

为建立一种快速检测鹿流行性出血热病毒(EHDV)的实时荧光RT-RPA检测方法,本研究根据EHDV保守的非结构蛋白NS1基因(segment 5)设计特异性引物和探针,建立了敏感、快速的EHDV核酸实时荧光RT-RPA检测方法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测EHDV核酸,与蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)等病原核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到8×10~1copies/μL;检测时间短,仅需15 min;重复性好。采用所建立方法对115份样品进行检测,结果与OIE推荐的实时荧光RT-PCR法检测结果相同。上述结果表明,本研究建立的实时荧光RT-RPA快速检测法操作简便,可用于基层实验室快速检测。

鹿流行性出血热病毒核心样颗粒的制备与鉴定

为制备鹿流行性出血热病毒(EHDV)的核心样颗粒(CLPs),本研究将鹿流行性出血热病毒(EHDV)L3与S7基因片段插入至昆虫杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dual中,构建重组质粒pFastBac-Dualvp3-vp7,并通过转座获得重组杆状病毒质粒Bacmid-vp3-vp7,随后转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-vp3-vp7。通过重组杆状病毒感染Sf9细胞共表达VP3和VP7蛋白,并利用蔗糖梯度离心进行纯化,两者组装形成CLPs。负染后通过透射电镜观察纯化产物的形态,Western-blotting验证其反应原性,免疫小鼠检验其免疫原性。结果显示,透射电镜下可以观察到纯化产物中含有大量的与EHDV形态相似的直径为60~70 nm的中空颗粒;以绵羊EHDV阳性血清为一抗的Western-blotting可以检测到大小分别为100 ku和38 ku的2条蛋白条带,分别与EHDV VP3和VP7蛋白大小一致;间接ELISA结果显示,3次免疫后可刺激产生的EHDV特异性抗体效价可达1∶12 800。上述结果表明,本研究获得了具有典型形态、良好反应原性和免疫原性的EHDV核心样颗粒(CLPs)。

口蹄疫等5种动物病毒基因芯片检测技术的研究

用分子克隆方法获得口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段 ,用芯片点样仪点样到包被过的玻璃片上 ,制备成检测芯片。提取样品中的RNA ,进行反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果进行扫描检测 ,可同时诊断上述 5种动物传染病 ,此方法不但快速、准确、敏感 ,而且可同时进行多种病毒的检测 。

4种动物虫媒病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的VSV、BTV、EHDV和AKV进行特异性扩增,所扩增的目的片段的长度分别为301、351、537、250bp。建立的四重RT-PCR检测方法能够检测出10-7稀释的细胞培养病毒液,4种病毒之间没有发生交叉反应,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。所建立的多重RT-PCR方法可用于上述4种动物虫媒病病毒的快速鉴别诊断,在动物检疫、临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

4种重要虫媒病的核酸液相芯片高通量检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血热病毒（EHDV）、阿卡斑病毒（AKV）、蓝舌病病毒（BTV）和水泡性口炎病毒（VSV）的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中BTV的VP7基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和VSV的NP基因序列进行序列分析,设计针对这些基因的特异性探针并标记生物素,分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与这些病毒相应基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪（Liquichip 200）检测荧光信号建立了以上4种虫媒病的快速液相芯片检测方法。检测结果显示,该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应,而不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度达到50~100个TCID50。本研究建立了可以同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水泡性口炎病毒的快速高通量液相芯片技术,为其他类似病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。

临床医学

20041395 应用巢式 PCR-杂交技术检出人血样及动物排泄物中弓形虫 DNA/骆红梅(杭州师范学院医学院 310012),楼兰花//中国兽医杂志.-2003,39(9).-12～14弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫,引起人兽共患疾病弓形虫病。本文报道了一种基于 PCR 技术检测宠物弓形虫的方法,该方法的特点是通过检测宠物排泄物中是否存在弓形虫包囊,从而诊断宠物是否为真实的传染源。由于宠物的排泄物容易采集,避免了复杂的采样程度,方便于检测。图2参620041396 猪瘟 RT-PCR ELISA 诊断方法的建立及其初步应用/孙世琪(中国农业科学院兰州兽医研究所730046),郭慧琛,尚佑军…//中国兽医科技.-2003,33(9).-3～6建立了检测猪瘟病毒(CSFV)的快速。