东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库构建及IGF2基因克隆与结构分析

【目的】从功能基因组学角度深入研究鹿茸软骨组织生长发育机理,探讨胰岛素样生长因子-II(IGF2)在鹿茸软骨组织生长发育过程中的作用。【方法】利用SMART技术构建了东北马鹿鹿茸软骨组织全长cDNA文库,并设计IGF2基因保守引物对该文库进行筛选。【结果】构建的未扩增文库滴度为1.8×106pfu·ml-1,文库重组率大于89.8%;插入片段平均长度约为1.2 kb;扩增文库滴度为1.4×1010pfu·ml-1;克隆东北马鹿IGF2基因(GenBank登录号:EF177491)CDS区为540 bp,编码179 aa长度的多肽,与GenBank中检索得到的猪、马、牛、羊、人、小鼠和大鼠IGF2基因进行比对分析显示,马鹿IGF2多肽无色氨酸(Trp),组氨酸(His)与苏氨酸(Thr)含量在8个物种中最高;重建系统树结果显示,东北马鹿IGF2与牛和羊IGF2基因具有最高的相似性。【结论】成功构建东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库并克隆到IGF2基因。

梅花鹿鹿茸干组织裸鼠皮下移植动物模型的建立

目的建立梅花鹿鹿茸干组织异种移植动物模型,并观察原始鹿茸干组织在异体继续生长和发育情况。方法将梅花鹿鹿龄为1周岁的初生鹿茸干组织(对照组用前额骨膜)移植到裸鼠头部皮下,观察移植物的生长情况。于移植后60 d切取移植物,同时提取移植物组织的RNA,以cDNA为模板,采用梅花鹿的X型胶原(ColX)的特异性引物进行PCR,检测移植物来源,并进行序列分析。结果实验组受鼠头部均观察到移植物的生长,移植后60 d,移植物平均直径可达8.03 mm,高度可达15.67 mm。PCR产物可见约200 bp的特异条带,测序结果与已报道的梅花鹿的ColX基因的mRNA序列同源性为100%。结论鹿茸干组织移植到裸鼠头部能够继续生长发育,裸鼠可作为研究鹿茸干组织再生发育规律及其调控机制的动物模型。

塔里木马鹿损伤与正常茸组织的转录组特征差异分析

为了探究损伤鹿茸的快速修复生长机制,挖掘与修复生长相关的候选基因,试验首先采集塔里木马鹿损伤后修复53 d(损伤组)与正常生长53 d(正常组)的茸组织,提取总RNA后,基于Illumi-na Nova Seq 6000高通量测序平台进行转录组测序,将过滤后序列与参考基因组的序列比对后筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs);然后对DEGs进行GO功能富集分析与KEGG信号通路富集分析;最后随机选取4个DEGs(IHH、IL2RA、BVES和LOC122686105基因)进行实时荧光定量PCR分析,验证转录组测序结果的可靠性。结果表明:损伤组与正常组之间存在56个DEGs;与正常组比较,损伤组有37个DEGs显著上调(|lb Fold Change|≥1,P<0.05),包括IHH、IL2RA、BVES、Wnt5b、COL9A2、CRMP5等,有19个DEGs显著下调(|lb Fold Change|≥1,P<0.05),包括LOC122686105、ALX3、VWF等;损伤组有23个显著上调(P<0.05)的GO二级条目,包括生物过程(biological process,BP)中的19个GO二级条目[骨骼系统发育(GO:0001501)、软骨发育(GO:0051216)等]、细胞成分(cellular component,CC)中的2个GO二级条目[肌纤维膜(GO:00042383)、闰盘(GO:0014704)]和分子功能(molecular function,MF)中的2个GO二级条目[蛋白结合(GO:0005515)、相同蛋白质结合(GO:0042802)],以及8个显著下调(P<0.05)的GO二级条目,包括BP中的7个二级条目[细胞外区域(GO:0005576)、化学稳态(GO:0048878)、骨骼生长(GO:0098868)等]和CC中的1个二级条目[蛋白的N端结合(GO:0047485)];损伤组有13条显著上调(P<0.05)的KEGG信号通路,包括Hedgehog信号通路、Wnt信号通路、类固醇的生物合成等,有9条显著下调(P<0.05)的KEGG信号通路,包括维生素的消化吸收、胆固醇代谢和PPAR信号通路等。在56个DEGs中,与鹿茸修复生长相关的候选基因有IHH、IL2RA、Wnt5b、COL9A2、CRMP5。经实时荧光定量PCR分析发现,与正常组比较,损伤组中IHH、IL2RA、BVES基因显著上调表达(P<0.05),LOC122686105基因显著下调表达(P<0.05),与DEGs定量结果变化趋势一致,转录组测序结果可靠。说明损伤状态会促进鹿茸骨骼系统与软骨的发育,IHH、IL2RA、Wnt5b、COL9A2、CRMP5等基因可能对损伤后鹿茸的快速修复生长起着直接或间接的作用。

鹿茸根部骨化组织可溶性钙提取工艺优化及钙转运效果评价

采用酸溶法提取鹿茸根部骨化组织中可溶性钙,探究不同酸种类、酸用量、提取时间、提取温度对鹿茸根部骨化组织可溶性钙含量的影响,通过正交试验优化骨钙提取的最佳工艺条件,检验不同浓度骨钙对Caco-2细胞的毒性作用,并构建Caco-2模型模拟体内肠道吸收环境,研究骨钙的转运效率。结果表明,最佳提取条件即苹果酸提取,酸用量为5%,提取温度为55℃,提取时间为70 min时,骨钙含量为(6.136±0.015)mg/g。体外模拟结果表明,骨钙对Caco-2细胞呈现低毒性作用且转运效率为CaCl2的2倍左右。该研究为开发新的钙源和提高鹿茸根部骨化组织的附加值提供了新的发展方向。