麦洼牦牛程序化人工授精技术操作规程

牦牛是川西北地区重要的生产、生活资料,与牧区人民的生活息息相关。为更好的开展牦牛繁育工作,提高牦牛数量、提升牦牛质量,最大限度的发挥优质种公牛价值,通过运用现代生物学手段同期发情和人工授精技术提升牦牛受胎率和繁殖率,促进川西北牧区草原畜牧业高质量发展,该文主要阐述牦牛程序化人工授精操作规程,希望给牦牛养殖户提供参考。

基于GBS简化基因组测序数据重建麦洼牦牛保种群系谱

旨在利用简化基因组测序技术(genotyping-by-sequencing,GBS)构建四川省龙日种畜场的3个麦洼牦牛保种群(全黑群、粉嘴群和弗洛群)系谱,为麦洼牦牛保种选育工作打下基础。本研究从3个保种群选取406头麦洼牦牛(全黑群211头、粉嘴群140头、弗洛群55头),采血提取DNA后进行GBS测序,利用获得的SNP对保种群亲缘关系展开研究,并初步构建系谱。结果:GBS测序后获得高质量SNP位点126122个。PCA分析(principal component analysis,PCA)表明粉嘴群和全黑群有明显的分化趋势,弗洛群与全黑群、粉嘴群部分个体聚类紧密。本研究共计算出164836个亲缘关系对,依据个体间的亲缘系数,判定出134个全同胞关系,912个半同胞关系,136个疑似亲子关系或全同胞关系,520个疑似半同胞关系或叔侄关系,205个疑似半同胞关系或叔侄关系或祖孙关系。结合群体进化树和亲缘关系分析,将保种群划分为12个家系(G1~G12)。家系遗传多样性分析结果表明,12个家系的观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)为0.2889~0.3055,期望杂合度(expected heterozygosity,He)为0.3074~0.3076,平均Ho低于平均He,表明12个家系均存在一定程度的近交,G8的Ho最小,为0.2889,其F IS最大,为0.0607。本研究利用GBS技术获得的SNP判定了麦洼牦牛保种群的亲属关系,并将保种群划分为12个家系,初步完善了保种群的系谱,为后续保种选育方案的实施奠定了基础。

氟尼辛葡甲胺对麦洼牦牛肠道菌群多样性的影响

【目的】探究口服给药氟尼辛葡甲胺对牦牛肠道菌群结构变化的影响,为氟尼辛葡甲胺在麦洼牦牛炎症性疾病治疗中的科学用药提供参考依据。【方法】麦洼牦牛按0.04 mL/kg的剂量灌服5%氟尼辛葡甲胺溶液,给药前后12 h内根据动物排便情况随时采样,以通用引物343F和798R扩增细菌16S rRNA序列V3~V4可变区,构建PE文库后利用Illumia测序技术对粪便样本进行微生物多样性分析。【结果】在PE文库覆盖率超过96.00%的条件下,各组粪便样本的OTU数量分布在1633~2435个,除幼龄麦洼牦牛给药后的OTU数量降低外,青壮年和大龄麦洼牦牛的OTU数量均有不同程度升高。在门分类水平上,给药前后麦洼牦牛粪便菌群结构组成中均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌群,变形杆菌门(Proteobacteria)相对丰度在给药后明显降低,而厚壁菌门/拟杆菌门的比例有不同程度升高趋势,尤其以幼龄麦洼牦牛最明显;在属分类水平上,除幼龄麦洼牦牛粪便Ruminococcaceae_UCG-014、青壮年麦洼牦牛粪便Prevotellaceae_UCG-004和大龄麦洼牦牛粪便Rikenellaceae_RC9_gut_group的相对丰度变化不明显外,其他菌属在不同年龄段麦洼牦牛粪便菌群结构组成中的相对丰度在给药前后均发生明显变化。给药后各组麦洼牦牛粪便样本中实际观测到的OTUs数量及Chao1指数和Shannon指数均呈不同程度的降低趋势,而Simpson指数的变化不明显。多元变量统计分析(Kruskal-Wallis和LEfSe)结果表明,在门分类水平上各组间差异较明显的有拟杆菌门、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门、梭杆菌门(Fusobazcteria)和Kieitimatiellaeota等;在属分类水平上各组间差异明显的主要有[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、拟杆菌属(Bacteroides)和Christensenellaceae_R-7_group等。【结论】单次灌服氟尼辛葡甲胺后,麦洼牦牛肠道菌群在门和属分类水平上均发生不同程度变化,但仍以厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌群,表明氟尼辛葡甲胺仅影响麦洼牦牛肠道菌群的相对丰度。

麦洼牦牛结节性皮肤病防治

牛结节性皮肤病(Lumpy Skin Disease,LSD),又称牛结节性皮疹,是由牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的一种牛全身性传染病。根据其发病情况,可分为3种类型:急性、亚急性和慢性。该疾病的临床特征主要是发热、消瘦、浅表淋巴结肿大、皮肤水肿,以及皮肤局部形成硬结节或破溃。麦洼牦牛是川西北牧区珍稀畜种资源和主要经济牲畜,主要生活在平均海拔3000 m以上的区域。随着麦洼牦牛牛肉及其副产品消费量及消费群体不断增大,市场需求逐年加大。频繁的跨区域引种和市场交易给麦洼牦牛养殖产业带来较大的疫病风险。科学预防和治疗牦牛结节性皮肤病对高原牧区畜牧业健康发展有重要意义。

三种不同外貌类型麦洼牦牛的屠宰性能比较

为比较不同外貌类型麦洼牦牛的屠宰性能,为麦洼牦牛本品种选育提供理论依据,本试验在同一天然草场分别选取纯黑、粉嘴和弗洛3种不同外貌类型的麦洼牦牛各3头进行屠宰,测定屠宰体重、胴体重、内脏组织重、眼肌面积、屠宰率等。结果显示:弗洛型麦洼牦牛的牛蹄重显著低于全黑型和粉嘴型,三种类型麦洼牦牛的内脏组织重、眼肌面积、屠宰率等无显著差异。说明不同外貌特征的麦洼牦牛的屠宰性能基本无差异。

麦洼牦牛H-FABP、HSL基因多态性及与生长性状的相关分析

【目的】探讨心脏脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein,H-FABP)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)基因在牦牛中的遗传多态性,进一步揭示牦牛各品系间的遗传分化以及候选基因与牦牛生长性状间的关联性,同时为2个候选基因在牦牛中的表达调控等研究提供理论依据,寻找可用于辅助选择的分子标记。【方法】采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对共100头麦洼牦牛个体的H-FABP、HSL基因的外显子部分进行遗传多态性分析,统计基因和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。【结果】①麦洼牦牛H-FABP、HSL基因外显子部分均存在多态性,多态性检验均存在3种基因型;②适合性检验表明仅HSL基因外显子8上多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,其余多态位点均偏离;③测序分析表明,H-FABP基因外显子4第7 339位(与原序列相比)发生单碱基突变(T→C),该突变属同义突变;HSL基因外显子7第6 883位发生G→C转换,以及第6816处发生碱基A→G突变,并导致编码氨基酸由天冬氨酸(D)转变为甘氨酸(G);外显子8第10 183 bp处发生A→G碱基突变,编码氨基酸由半胱氨酸(C)变为甘氨酸(G);④对各标记基因型生长发育指标(体高、体斜长、胸围、管围、体重)进行差异显著性检验,仅HSL基因外显子7上A6816G基因座差异极显著(P﹤0.01)。【结论】麦洼牦牛H-FABP、HSL基因存在遗传多态性,且HSL基因外显子7上A6816G基因座表现的多态有可能作为一种遗传标记。

麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因的SNPs检测及其与体尺性状的关联分析

旨在探讨生长激素(Growth hormone,GH)、生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)、生长激素促分泌素受体(Growth hormone secretagogue receptor,GHSR)基因在麦洼牦牛中的遗传多样性,揭示不同基因型与其生长性状的关联性,同时为候选基因在牦牛中的表达调控提供理论依据,寻找可用于遗传育种辅助选择的分子标记。本试验采用DNA池技术,结合PCR-RFLP和直接测序法研究麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因的遗传多态性,分析候选基因多态位点与体高、体斜长、胸围、管围和体重等生长性状的关联性。结果表明:1)麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因均存在多态性,其中GH基因存在A757G和T949C2个SNPs位点,GHR基因发现T2416C、T3490C和A7500G3个突变位点;GHSR基因存在T1387C和T3006C突变;2)适合性检验表明,GHR基因A7500G位点在粉嘴类群,及GHSR基因T3006C位点在纯黑类群中偏离Hardy-Weinberg平衡状态,其他位点均符合Hardy-Weinberg平衡;3)差异显著性检验表明,GHR基因T2416C、T3490C和A7500G位点与麦洼牦牛管围极显著相关(P<0.01),GHSR基因T1387C位点与其体重显著相关(P<0.05)。麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因均存在遗传多态性,推断GHR基因T2416C、T3490C和A7500G位点、GHSR基因T1387C位点可能是影响麦洼牦牛管围、体重性状的主基因或与主基因相连锁的基因座,可作为辅助选择的遗传标记。

麦洼牦牛TLR1～10基因克隆及分子生物学特征分析

本研究克隆了麦洼牦牛天然免疫受体1~10基因的编码区,利用生物信息学工具分析基因特点,荧光定量PCR测定TLRs基因在不同组织中的表达量。序列比较分析结果表明,麦洼牦牛TLR基因与其他物种在核苷酸水平及氨基酸水平上均表现出很高的保守性。遗传进化方面,麦洼牦牛TLRs与牛和绵羊TLRs遗传进化距离最近,并与人、马、鼠TLRs等形成哺乳动物的一个分支,与鸡则形成遗传距离较远的一个分支。同时我们在进行系统发育分析时发现,TLR1、TLR6先聚为一小支,再与TLR10又聚为更紧密的一支,然后TLR1、2、6、10和TLR7、8、9分别聚集在两个单个的分支上,TLR其他成员各自成为一支。荧光定量结果表明,TLRs在麦洼牦牛各组织均有表达,但不同成员在不同组织的表达存在较大的差异。其中TLR2、TLR4和TLR6在脾表达量最高,在卵巢、小肠、肾、肝中有高表达,TLR1、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9和TLR10在肾表达量最高,在肝、肾、脾等组织中高表达。综上所述,本研究的开展能为以后揭示TLRs在牦牛等高原模式动物分子免疫机制以及牦牛抗病育种奠定基础。

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析.结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5,端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型.在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率.麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大.

麦洼牦牛TLR1基因组织表达分析

【目的】建立一种牦牛TLR1基因表达量的荧光定量PCR检测方法,并分析TLR1基因在牦牛不同组织中的表达差异。【方法】参考牦牛TLR1基因序列,在其保守区设计特异性引物,并以牦牛β-actin基因为内参基因建立荧光定量方法;基于该荧光定量方法分析TLR1基因在牦牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、乳腺、肌肉、卵巢11种组织中的表达水平。【结果】TLR1基因和β-actin基因扩增产物电泳结果呈现单一条带,其产物熔解曲线均为特异的单峰,表明引物具有较高的特异性。组织表达结果显示,TLR1基因在所检测的牦牛11个组织样本中均有表达,其中在肾、肝、脾、肺、卵巢、小肠中表达量较高,在胃、乳腺、心、大肠、肌肉组织中表达量较低。【结论】TLR1基因在牦牛各组织中转录水平差异较大,这可能与各组织对病原体的识别和抵抗能力有关。

麦洼牦牛和九龙牦牛乳蛋白遗传多态性的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对109头麦洼牦牛和100头九龙牦牛乳蛋白多态性进行分型,并采用最小二乘法分析乳蛋白多态性与泌乳性能及乳蛋白组分之间的相关性。结果表明:β CN、κ CN和α La呈单态,基因型分别为AA、BB和BB型;而αs1 CN和β Lg呈多态,αs1 CND基因为优势基因,在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0.8073和0.6000,β Lg座位优势基因为β LgE,在麦洼牦牛和九龙牦牛中的频率分别为0.9770和0.9700;麦洼牦牛和九龙牦牛群体平均杂合度分别为0.1021和0.1867;在2个品种牦牛群体中,除αs1 CN基因座对九龙牦牛乳脂率有显著影响外,其余乳蛋白基因座对泌乳性能及乳蛋白相对百分含量均无显著影响。

麦洼牦牛产奶变化规律研究

为了探索麦洼牦牛泌乳的变化规律,收集了四川龙日种畜场2003-2009年间产犊母牦牛的产奶数据,分析了暖季牦牛泌乳的变化规律.结果表明,产犊后30～70 d时,牦牛日产奶量逐步升高,70～110 d时达到高峰期,110d后日产奶量逐步降低至不挤奶;麦洼牦牛日产奶量受年度效应的影响较小;不同日龄的挤奶量之间相关性较强.

麦洼牦牛SRY基因克隆及序列分析

SRY是Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段,是多数哺乳动物性别决定基因之一。本试验采用克隆测序SRY基因并结合生物信息学对其序列进行分析,利用软件Codon W分析麦洼牦牛、普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡和人该基因编码区的密码子偏好性。克隆测序得到SRY基因序列含1个690bp的开放阅读框,共编码229个氨基酸;其编码区核苷酸序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡、人相应序列间的一致性分别为99.9%、93.9%、91.2%、76.5%、43.3%、21.4%、69.1%。经聚类分析,麦洼牦牛首先与普通牛聚在一起,绵羊与山羊聚为一类,这两类相聚后再依次与猪、人、小鼠相聚,最后与鸡聚为一类,其结果与以往的生物学分类结果一致。该基因编码的蛋白质分子式为C1155H1827N351O348S11,相对分子质量为2655.0,理论等电点PI为9.55,亲水性平均数为-0.855。其密码子偏好性分析显示,T3s为0.2905、C3s为0.3240、A3s为0.3728、G3s为0.2963,第3位碱基中出现G和C占第3位碱基总量的48%,同义密码子数为61。上述数据表明麦洼牦牛SRY基因编码序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、人具有较高的一致性,在物种进化过程中较为保守。该基因对含A的密码子有较高的偏爱性,尽量避开以G结尾的密码子,且其所编码的蛋白质为亲水性蛋白。

全哺乳饲养方式麦洼牦牛公犊肉的营养及品质分析

为了解全哺乳饲养方式麦洼牦牛公犊肉的营养及肉质性状,对6月龄和18月龄麦洼牦牛公犊进行了屠宰测定。结果表明:6月龄和18月龄牦牛公犊的脂肪含量分别为1.43%、1.25%,蛋白质含量分别为22.92%、22.59%,其间均无显著性差异;水分含量6月龄为77.28%,显著低于18月龄(78.30%)。矿物质元素锰含量6月龄为0.20mg/kg,显著高于18月龄(0.13mg/kg),其他矿物元素间均无显著性差异。氨基酸各指标含量间均无显著性差异。6月龄牦牛公犊的饱和脂肪酸(SFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)、氨基酸总量(TAA)、必需氨基酸(EAA)分别为64.53%、1.61%、19.95%、7.75%,均高于18月龄;单不饱和脂肪酸(MUFA)、PUFA/SFA分别为33.85%和0.02,均低于18月龄,但其间均无显著性差异。重金属镉、铬、砷、铅和汞含量均远低于国家标准(GB2762-2005)的限量值,均未检测到六六六、滴滴涕、五氯硝基苯、金霉素、土霉素和磺胺类药物残留。6月龄和18月龄牦牛公犊肉具有高蛋白、低脂肪的特点,且矿物质及氨基酸含量丰富,属于优质蛋白质食物,是绿色、安全、环保、无污染的优质肉食品。

麦洼牦牛群体4个新微卫星位点遗传多态性分析

【目的】利用4个新分离的牦牛基因组多态微卫星位点,分析麦洼牦牛的遗传多态性及群体的遗传分化特征。【方法】以130个麦洼牦牛个体基因组DNA为模板,PCR扩增Bogr203、Bogr204、Bogr205和Bogr215 4个微卫星位点序列,通过测序进行基因分型,根据基因型计算各个位点的多态性,并推断麦洼牦牛群体的遗传分化特征。【结果】麦洼牦牛群体在4个微卫星位点具有较高的遗传多态性,平均观察杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和平均多态信息含量(PIC)分别达到0.626,0.800和0.751;通过Structure软件能够较明确地将麦洼牦牛群体区分为2个亚群,这与麦洼牦牛分布地域广泛有较大关系,但各个亚群的牦牛个体及其分布区域还需要进一步研究。【结论】麦洼牦牛品种具有较高的遗传多态性,并可能分化为至少2个亚群。

麦洼牦牛Hoxa10基因克隆、原核表达及组织表达谱

从麦洼牦牛肾脏组织提取总RNA,以已公布牛Hoxa10编码区序列设计引物,RT-PCR法克隆麦洼牦牛Hoxa10基因;构建原核表达载体pET-32a(+)-Hoxa10,并在大肠杆菌表达系统中表达,SDS-PAGE检测融合蛋白;采用RT-PCR检测该基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布。结果表明:从麦洼牦牛肾脏中克隆Hoxa10基因的CDs区,大小为285bp,编码94个氨基酸残基,与牛、猪和绵羊的Hoxa10同源性高;经IPTG诱导,pET-32a(+)-Hoxa10在BL21中可表达1个大小约为28ku的特异蛋白;在牦牛各组织中,肾脏和肺脏中表达较高,但在心脏表达量极低或不表达。

麦洼牦牛和九龙牦牛乳酸脱氢酶H亚基的遗传变异体

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ,对 1 0 9头麦洼牦牛和 1 0 0头九龙牦牛乳中的乳酸脱氢酶 (LDH)同工酶进行检测。结果表明 :两品种牦牛乳中 LDH在凝胶上仅显示出由 4个 H亚基组成的 LDH1 1条区带。试验共检测到 4种 LDH1 的遗传变异体 ,按迁移率由大到小依次为 A、B、C、D,其中 D型仅存在于九龙牦牛中 ,C型在两品种牦牛中均占明显优势。麦洼牦牛和九龙牦牛 LDH1

麦洼牦牛乳腺上皮细胞系的建立及其生物学特性

为建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,采用组织块贴壁法及Ⅰ型胶原酶消化法,从麦洼牦牛乳腺组织中成功分离并获得纯化的乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力等生物学特性的检测,建立并鉴定麦洼牦牛乳腺上皮细胞系。结果显示,乳腺细胞形态良好,细胞接种存活率达91%,群体倍增时间26.97h,细胞生长曲线呈典型"S"型,细胞传至25代以上仍保持旺盛的增殖活力。可见,通过对细胞传代及反复冻存和复苏已成功建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞系,获得大量的乳腺上皮细胞,使麦洼牦牛物种在细胞水平上得以保存,为建立牦牛乳腺生物反应器及泌乳调控机制研究提供基础。

麦洼牦牛暖季补饲育肥效果研究

本试验通过不同补饲水平对28头3岁麦洼牦牛150d育肥效果测定,补饲组18头全期平均总增重67.73kg,平均日增重451.67g,相对增重率47%;高水平补饲的A组头平均增重比不补饲D组高34.5kg,日增重高230g,两项指标比对照组相对提高近70%。试验表明,在高寒牧区,暖季对牦牛进行适量补饲,能提高生长速度,使其提前出栏。

麦洼牦牛乳蛋白多态性与泌乳性能相关性的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)对 10 9头麦洼牦牛乳蛋白多态性进行分型 ,并采用最小二乘法分析乳蛋白多态性与泌乳性能及乳蛋白组分之间的相关性 ,结果表明 :β CN、κ CN和α La呈单态 ,而αs1 CN和 β Lg呈多态 ,优势基因型分别为DD和EE型 ,频率分别为 0 .7798和 0 .95 4 1。