微量精子麦管冷冻法在ICSI中应用的安全性研究

目的 评价微量精子麦管冷冻法在ICSI中应用的胚胎实验室指标、临床妊娠结局以及出生子代健康等的安全性。方法 回顾性分析2021年1月至2022年12月于我院生殖医学科因男方为微量精子行ICSI患者的临床资料,行麦管冷冻精子共84例1 080枚成熟卵子为麦管冷冻组,同时期的新鲜微量精子为新鲜精子组,共48例554枚成熟卵子,并对所有受试者进行随访。对比两组患者的精子活率、精子活力、受精、胚胎培养、接受胚胎移植的妇女的妊娠结局、新生儿相关信息以及子代健康随访结果。结果 两组女性患者一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组男性患者的疾病类型和精子获取模式比较,差异有统计学意义(P<0.01)。麦管冷冻组精子复苏后的活率为25.35%,精子活力为15.22%。新鲜精子组精子的活率为35.56%,精子活力为25.32%,两组比较,差异显著(P<0.05)。两组的获卵数、成熟卵子率、受精率、D3优质胚胎率、D5囊胚形成率、D5优质胚胎率、平均移植胚胎数、临床妊娠率、累计临床妊娠率、流产率、早产率、活产率、出生缺陷率、平均出生体重和子代健康随访结果比较,差异无统计学意义(P>0.05);麦管冷冻组的流产率为3.57%、新鲜精子组的流产率为20.83%,两组比较,差异有统计学意义(P=0.013);麦管冷冻组的活产率为48.04%,新鲜精子组的活产率为32.73%,两组比较,差异有统计学意义(P=0.030)。结论 与新鲜精子相比,微量精子通过麦管冷冻法复苏之后精子活率和活力会有所下降,但选择合适浓度的精子行麦管冷冻可获得足够的精子用于ICSI,在ICSI中应用麦管冷冻保存明显降低了流产率,同时提高了活产率,具有较高的安全性。

温度和冻存液体积与冷冻液接触时间对双层麦管法冻存小鼠卵子的影响

目的探讨温度和冻存液体积与冷冻液接触时间对双层麦管法冻存小鼠卵子的影响。方法90只KM品系雌鼠注射激素,使其超数排卵,以获得形态良好的带放射冠的卵子,采用双麦管法玻璃化冷冻与复苏带放射冠的卵子。根据不同操作温度(22℃、37℃)、冷冻液接触时间(>30~40、>40~90、90~180 s)、冻存液体积(>0.1~0.5μl、>0.5~1.0μl)分别冷冻,比较各种冷冻条件下的卵子存活率。结果操作时间为40~90 s,冻存液体积为0.1~0.5μl时,22℃卵子存活率高于37℃,差异有统计学意义(P<0.05)。22℃环境下,冻存液体积为>0.1~0.5μl时,>40~90 s操作时间小鼠卵子存活率高于>30~40、>90~180 s,>90~180 s操作时间小鼠卵子存活率高于>30~40 s,差异有统计学意义(P<0.05)。在22℃环境下,操作时间为>40~90 s时,>0.1~0.5μl冻存液体积小鼠卵子存活率高于>0.5~1.0μl,差异有统计学意义(P<0.05)。结论应选择22℃环境温度,>40~90 s的操作时间,>0.1~0.5μl的冻存液体积冻存带有放射冠的小鼠卵子,效果最佳,存活率最高。

封闭式麦管玻璃化冷冻法用于人早期胚胎冷冻效果观察

目的探讨封闭式麦管玻璃化法用于人早期胚胎(以下简称胚胎)冷冻的效果。方法将接受体外受精—胚胎移植(IVF-ET)患者移植后第3天的胚胎分别采用封闭式麦管玻璃化法(玻璃化组)及程序化慢速冷冻法(程序化组)冷冻,比较两组胚胎存活率、完全胚胎存活率、继续卵裂率及植入率、妊娠率和流产率等。结果玻璃化组的胚胎存活率、完全胚胎存活率、植入率明显高于程序化组,周期取消率明显低于程序化组(P均<0.05);继续卵裂率、临床妊娠率、流产率,两组比较均无显著性差异(P>0.05)。结论封闭式麦管玻璃化法用于人早期胚胎冷冻可简化冷冻程序,更好地保存胚胎复苏后的发育潜能。

麦管玻璃化技术的热特性研究

研究了普通麦管和拉伸麦管在玻璃化保存过程中的降温速率和复温速率 ,结合溶液差示扫描量热曲线进行分析。研究表明采用拉伸麦管可将降温速率由普通麦管的 2 50 0～ 4 70 0K/min提高到 1 1 4 0 0～ 1 84 0 0K/min ;将复温速率由普通麦管的 4 2 0 0～ 6 70 0K/min提高到 1 2 2 0 0～ 32 30 0K/min。某些溶液解冻时的反玻璃化问题更需要重视 ,拉伸麦管的复温速率高于降温速率 ,有利于防止反玻璃化产生。

不同浓度甘油冷冻保护剂和冷冻麦管规格对七彩鲑受精率的影响

以5%～30%浓度的甘油作为精液冷冻保护剂,以0.5 mL麦管和1.8 mL麦管作为精液冻存容器,进行七彩鲑冻精的受精试验。试验结果表明:20%浓度甘油组的受精率达到了51.08%～61.56%,显著高于其他浓度甘油组的受精率;在20%～25%甘油浓度中0.5 mL麦管组的受精率均高于1.8 mL麦管组的受精率,其中20%甘油的0.5 mL麦管组,平均受精率最高,达到了61.38%。

麦管玻璃化法冻存人早期胚胎的临床应用

目的探讨麦管玻璃化法冷冻技术的临床应用效果。方法应用麦管玻璃化法冷冻技术保存17例患者的116枚4～8细胞期胚胎。结果复苏了7例患者的37枚胚胎,存活25枚,胚胎存活率为67.56%,其中完整胚胎24枚,移植23枚,种植2枚,种植率为8.69%(2/23),1例获得妊娠,妊娠率为12.5%(1/8),并足月剖宫产一健康女活婴。结论麦管玻璃化法是一种可应用于临床的冷冻保存人早期卵裂期胚胎的技术。

应用两种麦管系统对小鼠囊胚的玻璃化冷冻

目的比较两种麦管系统对小鼠囊胚的玻璃化冷冻比较,以期建立一种有效的囊胚冷冻方法。方法分别应用开放麦管系统和传统麦管系统对小鼠扩张囊胚进行玻璃化冷冻,比较冷冻复苏以后囊胚的存活率和孵出率。结果应用开放麦管系统冷冻的小鼠囊胚复苏后的存活率(82.3%)显著高于应用传统麦管系统者(68.6%, P<0.01)。前者冷冻的小鼠囊胚复苏后的囊胚孵出率(70.3%),也明显高于应用传统麦管系统者(57.1%, P<0.05)。结论应用开放性麦管系统进行小鼠囊胚的玻璃化冷冻是一种行之有效的冷冻方法。

麦管玻璃化法冷冻保存人诱导多能干细胞

目的:麦管玻璃化法冷冻保存人诱导多能干细胞(induced pluripotent cells,iPS细胞)。方法:将机械法切割的iPS细胞团块,依次在10%玻璃化冷冻液和20%玻璃化冷冻液中处理后保存于20%的冷冻液中,封装于0.25 ml麦管并快速置于液氮中保存。解冻时将iPS团块依次置入0.2 mol/L蔗糖溶液和0.1 mol/L蔗糖溶液后,接种至饲养层上培养。检测复苏效率,并对解冻后长期培养的iPS细胞进行特性鉴定,包括:碱性磷酸酶染色、OCT4等免疫荧光染色、RT-PCR法检测内源性oct4和sox2的表达、拟胚体(embryoid,EB)分化、神经细胞分化和畸胎瘤分化能力检测等。结果:麦管玻璃化法冷冻保存的iPS细胞解冻后复苏率可达(77.40±13.12)%,解冻后iPS长期传代培养能维持其特性:碱性磷酸酶阳性,OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1-60免疫染色阳性,RT-PCR可检测到内源性oct4和sox2的表达,具备EB、神经细胞和畸胎瘤分化能力。结论:麦管玻璃化冷冻技术可以有效保存iPS细胞,解冻后的iPS细胞在后续传代培养中仍然保持其特性。

稀少精子麦管法不同冷冻方法的实验研究

目的优化稀少精子冷冻方法,缓解临床治疗无精子症或少、弱精子症患者的不育问题。方法使用麦管容器和改良甘油-卵黄-枸橼酸钠(GYC)型冷冻保护剂,利用上游法将密度调整至(3～5)×106/ml,以液氨熏蒸方式冷冻。结果利用麦管液氮熏蒸法,平均精子复苏率为(47. 81±14. 32)%,冷冻复苏后正常形态率为(4. 58±2. 32)%,冷冻复苏后DNA碎片率为(9. 27±5. 10)%,高于其他方案,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论应用麦管加保护剂液氮熏蒸冷冻模式冷冻复苏后,稀少精子的各项特征参数均较优,是一种行之有效的方法。

早地麦管理

由于早地麦主长前期温度高、湿度大，促使病虫杂草滋生蔓延，尤其是９月前播种的早地麦山地杂草较多．管理工作显得尤为重要。１迅速查苗排队，分类治虫，加强药剂防治。２麦苗在二叶一芯至三叶期用２５％绿麦隆２００～３００克兑水５０千克搅拌均匀喷雾可消除杂草。３麦苗在孕穗前后发病时，每亩用２５％粉锈灵５０克兑水５０千克喷施一次，药效可达３０天左右，对高度感病的品种或重病的小麦可喷施两次。每次每亩药量可适当增至７０－８０克，防效很好。４因地制宜追施肥料和中耕除草。小麦拔节前结合自然降雨，追施尿素每亩５－１０千克，或者用生物钾１千克兑水６０千克浅灌于麦苗根际，结合人工薅除不但能增产。

新型超微量冷冻麦管：微量精子冻融安全有效新载体(附83例报道)

目的探讨新型超微量冷冻麦管(LSL管)冻存微量精子的冻融结果。方法回顾性分析83例严重男性不育症患者采用LSL管冻存精子的冻融结果,观察其中23对夫妇因男性因素解冻LSL管精子行卵胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的妊娠结局。结果不同来源的微量精子采用LSL管复苏后89.5%(94/105)可见活动精子,进入辅助生殖周期的标本可使用率为73.9%(17/23)。在18个ICSI周期中,受精率、卵裂率、可用胚胎率和优质胚胎率分别为78.0%、92.5%、62.7%和40.6%;种植率、临床妊娠率和累计活产率分别为31.1%、52.5%和55.6%。获得的所有12个活产儿均未见出生缺陷。结论 LSL管是一种可用于微量精子冷冻保存的安全有效新载体,可广泛使用于辅助生殖治疗。

冷冻载体对扩张期囊胚解冻结局的影响

背景:囊胚的冷冻复苏对人类辅助生殖技术的发展具有重要意义,合适的冷冻载体可以降低冷冻毒性提高冷冻效率,是改善囊胚冷冻复苏结局的研究热点之一。目的:观察不同冷冻载体对昆明小鼠扩张期囊胚玻璃化冷冻解冻结局的影响。方法:以新鲜昆明小鼠扩张期囊胚作为对照组,随机选取同期小鼠胚进行玻璃化冷冻解冻,冷冻前使用激光仪行人工皱缩,使用玻璃化法进行冷冻和解冻,按实验载体不同分为冷冻环组、闭合拉细麦管组和自制麦管叶片组;冷冻环组和自制麦管叶片组投入液氮前与冷冻保护剂接触时间<40s,40-60s和60-90s;解冻后囊胚使用胚胎囊期培养基添加10%血清替代品进行微滴培养。比较解冻后组间囊胚丢失率、囊胚复苏率和培养24h囊胚孵出率。结果与结论:相比闭合拉细麦管组,冷冻环组和自制麦管叶片组的囊胚丢失率降低,胚胎复苏率增高(P<0.05),各冷冻组复苏囊胚培养24h孵出率均低于对照组(P<0.05)。使用冷冻环载体和自制麦管叶片载体冷冻解冻囊胚,投入液氮前与冷冻保护剂接触时间90s内不同时间胚胎复苏率和孵出率的比较差异无显著性意义。结果说明冷冻环载体和自制麦管叶片载体用于昆明小鼠扩张期囊胚玻璃化解冻复苏的效果较好。

不同冷冻载体对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

目的:探讨玻璃化冷冻小鼠成熟减数第二次分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的最佳冷冻载体及冷冻方法。方法:用乙二醇和蔗糖为玻璃化冷冻保护剂,将小鼠成熟MⅡ期卵母细胞分为冻融、暴露和对照组。冻融组分别采用普通麦管、封闭式拉细麦管(CPS)和开放式拉细麦管(OPS)作载体,采用玻璃化快速冷冻和快速复温的方法冻存小鼠成熟卵母细胞;暴露组卵母细胞仅暴露在冷冻和复苏液中,不进行冷冻;对照组卵母细胞不接触冷冻和复苏液。观察各组处理后卵子回收、受精、卵裂等情况。结果:冻融组普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞回收率分别为92.0%、92.3%和72.3%,OPS处理卵母细胞的回收率显著低于普通麦管和CPS处理的卵母细胞(P<0.001);普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞复苏存活率分别为43.5%、72.2%和76.5%,CPS和OPS处理卵母细胞的复苏存活率显著高于普通麦管组处理的卵母细胞(P<0.001)。冻融、暴露和对照组的卵裂率分别为38.6%、69.2%和73.5%,冻融组显著低于暴露和对照组(P<0.001)。结论:CPS法在玻璃化冷冻保存成熟的卵母细胞方面有价值。

几种因素对牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存的影响

鱼类胚胎冷冻保存技术还远没有成熟, 为了寻找最佳的鱼类胚胎玻璃化冷冻保存条件, 我们以牙鲆(Paralichthys olivaceus) 胚胎为例, 研究了影响鱼类胚胎玻璃化冷冻保存的几个主要因子: 玻璃化液、麦管直径、胚胎阶段、平衡时间及平衡温度、洗脱浓度和洗脱时间。发现: (1) 含有多种抗冻剂的玻璃化液PMDD(2% PVP), 玻璃化稳定, 脱玻璃化率较低, 适宜进行玻璃化冷冻; (2) 尾芽期胚胎较其他时期耐受力强, 平衡40 min就足以使玻璃化液渗透完全, 时间延长, 成活率显著降低, 各个时期的胚胎对温度都比较敏感, 0°C与4°C下平衡的成活率显著高于15°C; (3) 洗脱浓度和洗脱时间对胚胎成活率影响不大; (4) 根据优化的条件, 对牙鲆两个时期的胚胎进行超低温冷冻保存实验, 共成活4次, 获得成活胚胎8粒, 其中7粒孵化出健康的鱼苗。本文为鱼类胚胎冷冻保存技术的建立提供基础资料, 并显示了牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存是可行的。

玻璃化快速冷冻仪在猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻中的应用

为了提高猪成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果,应用玻璃化快速冷冻仪(Vit-Master)进行猪成熟卵母细胞的冷冻,以观察其冷冻效果。结果显示:浆状液氮降温速率[(21 345±l768)℃/min]远远高于普通液氮降温速率[(11 982±1 936)℃/min];各组冻后形态完整率无显著差异;冻后存活率为:使用玻璃化快速冷冻仪的不同浓度保护剂组[A':(57.87±10.66)%、B':(76.5±10.33%)、C':(79.07±14.90)%和D':(81.94±6.98%)]均分别高于对应的不使用玻璃化快速冷冻仪组[A:(49.73±2.91)%、B:(60.63±12.45)%、C:(71.33±14.38)%和D:(78.50±7.40)%],但均无显著差异,B'和C'组均高于C和D组,但差异不显著,A和A'组均显著低于B'、C'和D'组。因此,通过使用Vit-Master冷冻装置提高冷冻速率,可以降低冷冻保护剂使用浓度并提高冻后存活率。

玻璃化冷冻人卵母细胞的临床应用:附一例成功分娩

人卵母细胞冷冻保存是女性生育力直接保存的一种方法。但由于卵母细胞自身生物学特性的影响，卵母细胞冷冻的妊娠率始终不高。本院采用玻璃化技术冷冻人卵母细胞2例，1例获得临床妊娠，目前已分娩。

睾丸精子和附睾精子冷冻保存研究

目的探讨以0.25ml麦管为载体,Irvine为精子冷冻保护剂的方法在睾丸精子和附睾精子冷冻复苏中的应用。方法收集2019年7月至2020年12月期间诊断性睾丸/附睾穿刺术后剩余的睾丸精子悬液样本10份和附睾精子悬液样本20份,以0.25ml麦管为载体,Irvine为精子冷冻保护剂进行冷冻复苏,评估冷冻复苏效果。结果冷冻前10份睾丸精子悬液样本活动精子数目为5~8条/(200HP,40个视野)。复苏后1份睾丸精子悬液样本活动精子数目为5条/(200HP,80个视野),5份睾丸精子悬液样本活动精子数目为3~4条/(200HP,80个视野),4份睾丸精子悬液样本活动精子数目为1~2条/(200HP,80个视野)。冷冻前20份附睾精子悬液样本精子活动率为(13.65±9.06)%,复苏后精子活动率为(6.85±4.61)%,显著性下降(t=6.521,P<0.001),复苏率为(49.88±7.96)%。结论以0.25ml麦管为载体,Irvine为精子冷冻保护剂的方法在睾丸精子和附睾精子冷冻复苏中有较好的复苏率,材料来源方便,冷冻复苏操作简便,储存空间小等优势适合实验室日常工作需要。

土壤气压势的计算方法研究

降雨入渗在一定的条件下会使土壤中形成包气带,进而产生气压势,气压势又会影响雨水的入渗过程。在前人的研究基础之上,提出了由假想麦管泡吹模型推出的计算公式作为包气带中气压势的经验计算公式,并用已有试验资料进行检验。对比结果表明,由假想麦管泡吹模型推导出的计算公式可以作为包气带中气压势的经验计算公式。

常用实验动物带血管蒂全卵巢灌注及冷冻保存方法

目的采用独创的已获专利授权的灌注针和灌注技术,对常用实验动物(成年兔、豚鼠和大鼠)的带血管蒂全卵巢进行灌注,研究可调节灌注针是否适用于不同体型动物全卵巢的灌注,同时采用经典的冷冻方案进行冷冻及解冻。方法分别取6只性成熟雌性中国大耳白兔、6只Dunkan-Hartley系豚鼠、6只SD大鼠各12个带血管蒂全卵巢进行实验。结果计数兔、豚鼠、大鼠3种动物卵巢组织HE染色切片中形态正常的原始卵泡率,结果显示差异均无统计学意义(P>0.05);血管损伤主要在远卵巢端,3种动物近卵巢端的各组动脉、静脉均未见明显损伤。结论通过调节麦管针的粗细可用于灌注大小不同的动物卵巢,初步证实了相同的灌注压力(60 mmHg)和灌注速率(1 ml/min)同时适用于不同体积的兔、豚鼠和大鼠卵巢。