海藻酸钙固定麦芽寡糖基海藻糖水解酶的研究

研究了一种用海藻酸钙包埋麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalosetrehalohydrolase,MTHase)的固定化新技术,比较了原酶与固定化酶的最适反应温度、最适反应pH值和热稳定性。结果显示:固定化酶的最适反应温度和稳定温度都由原酶的60℃提高到65℃;固定化酶的最适反应pH值较原酶的5.5降低到5.0。表明MTHase的固定化能有效地提高它的耐热性及耐酸性。这对在未来的海藻糖工业生产中,降低微生物的污染和增加淀粉的溶解度,在更高的反应温度条件下进行海藻糖的合成,提供了一个新思路。

谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆与表达

从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因(treZ),将其插入大肠杆菌表达载体pRSET-B并转化宿主菌E.coliBL21(DE3)pLysS获得重组基因工程菌。经IPTG诱导表达,得到麦芽寡糖基海藻糖水解酶,溶解表达的目的蛋白约占胞内总蛋白的40%,有部分目的蛋白形成包涵体。经薄层层析与离子色谱共同检测证实,该麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)与麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)共同作用于糊精溶液,可得到产物海藻糖,具有工业应用前景。

来源于玫瑰微球菌的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在大肠杆菌中的融合表达

设计引物克隆玫瑰微球菌QS412中麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的基因treZ,通过与pET-28a(+)载体相连,转化入宿主菌E.coli BL21,进行发酵诱导。通过SDS-PAGE检测到外源基因在大肠杆菌中有很高的MTHase表达量,但大部分都以不溶性包含体形式存在。对菌体超声破碎全菌液检测酶活,结果显示了水解酶酶活。这是来源于微球菌属的麦芽寡糖基海藻糖水解酶首次获得基因克隆和活性表达,为进一步提高酶活、增大海藻糖产量奠定了基础。

发状念珠藻中麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆和序列分析

从发状念珠藻(Nostoc flaglliforme)中克隆出麦芽寡糖基海藻糖基水解酶MTHase的基因TreZ,对该基因核苷酸序列测序表明开读框全长1848 bp,编码的蛋白质有615个氨基酸.根据基因序列预测的TreZ氨基酸序列具有MTHase的催化功能保守区.发菜TreZ和TreY与点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的TreZ和TreY有很高的同源性.结果初步表明:可以从发状念珠藻中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ,为进一步研究海藻糖代谢在发状念珠藻抗逆机理的工作奠定了理论和实验基础.

Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变株的酶学性质及其制备海藻糖的条件优化

来源于古细菌嗜酸热硫矿硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,MTHase)是双酶法生产海藻糖的关键酶。对1株蛋白表达量提高1.9倍的突变株L202P/L218D/Y323G进行酶学性质方面的测定和海藻糖转化。对突变株L202P/L218D/Y323G Sa MTHase进行最适温度、最适pH值、pH稳定性和60℃半衰期的测定,发现该突变株的酶学性质未发生较大变化。将麦芽四糖基海藻糖为底物,测定突变株L202P/L218D/Y323G Sa MTHase酶动力学相关参数。将麦芽糊精(DE值5~7)作为底物,利用嗜酸热硫矿硫化叶菌的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase,MTSase)与突变株L202P/L218D/Y323G Sa MTHase以不同比例作用于底物生产海藻糖,海藻糖的转化率最高达到76.0%。

定点突变鉴定Myxococcus sp.V11麦芽糖基海藻糖水解酶MTHase的催化中心

【目的】麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是一种水解与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成麦芽寡糖和海藻糖,是以淀粉为底物生产海藻糖工艺中的关键酶。实验室从菌株Myxococcus sp.V11基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因并异源表达,通过氨基酸序列分析和三维建模,推测其可能的催化中心氨基酸残基构成。【方法】通过对MTHase上可能存在的3个活性位点D256、E291、D386进行PCR介导定点突变,分别将其突变成为D256A、E291A和D386A。【结果】系统进化树结果表明Myxococcus sp.V11所产MTHase与已报道的Deinococcus radiodurans所产麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase,DR0464)相似度最高,但仅为49.23%,与已报道的淀粉酶相似度则有较大差异。氨基酸序列比对结果表明MTHase与其它来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶都具有相同的保守序列:GTFTPEG(113-119)、WGYDG(153-157)、ED(291-292)、GLXVXLDXVXNHXGPXGNY(184-202)、DGXRXDA(251-257)、IQNHDQ(382-387)。三联体活性中心(Asp256-Glu291-Asp386)均位于保守区域之内,其中Asp256是亲核试剂,Glu291是酸碱催化的质子供体,Asp386起着维持Glu291稳定构象的作用。以已解析的相似性最高的麦芽寡糖基海藻糖水解酶(PDB ID:2BHU)为模板,在SWISS-MODEL上通过同源建模得到MTHase的三维结构模型。MTHase与2BHU虽然相似性仅为49%,但都具有一个典型GH13家族糖苷水解酶所共有的(α/β)8桶状结构域。三维结构显示MTHase主要由3个结构域构成:催化结构域Domain A(Ala95-Asp316,Gln372-Ser512)形成一个典型的(α/β)_(8)桶状结构,Domain A的中间形成一个裂口,活性中心位于口袋之内;N端结构域(Domain B)主要为β-折叠结构,Domain C也由β-折叠构成,催化三联体Asp256-Glu291-Asp386位于靠近Domain C的位置。MTHase与底物连接的氨基酸残基Gly197,Pro198,Gly200,Asn201,Tyr202,Trp210,Asp316,Asp317,His320,Tyr337,Arg366,Asn390均与2BHU一致。通过定点突变,重组表达和活力测定,结果显示突变子D256A、E291A和D386A均彻底失去了淀粉酶活性。【结论】MTHase的活性中心由D256、E291和D386构成,与底物结合的氨基酸位点决定了其对不同底物的适应性。

海藻糖的MTSase及MTHase酶促合成条件的研究

本室收藏一株产 MTSase和 MTHase两酶并能将淀粉水解物转化为海藻糖的菌株 Micrococcus luteus。实验发现 ,菌体在对数生长期细胞内的 MTSase和 MTHase累积量极少 ,但在其基本停止生长后继续培养 12 h,胞内MTSase和 MTHase两酶含量急剧增加。两酶联合作用的最适反应条件为 p H6 .5 ,温度 4 0℃ ;最适底物是 DE值为11.6、浓度为 15 %的淀粉水解液。

重组Athrobacter ramosus S34MTSase和MTHase的酶学性质及其制备海藻糖的应用条件优化

以淀粉为底物,通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltosyltrehalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltosyltrehalose hydrolase,MTHase)的共同作用生产海藻糖是一种经济高效的方法。对Arthrobacter ramosus S34来源并分别在E.coli BL21(DE3)中表达的MTSase和MTHase的酶学性质进行研究,发现MTSase的最适温度为45℃,最适pH为7.0,MTHase的最适温度为55℃,最适pH为6.0。随后用2种酶共同作用生产海藻糖,优化反应条件,考查反应温度、初始pH、底物DE值、加酶量以及底物浓度等因素对酶转化过程中海藻糖产率的影响。最佳酶转化条件为反应温度45℃、初始pH5.5,底物DE值8.5,加酶量分别为MTSase最小加量15.75 U/g淀粉,MTHase最小加量7.5 U/g淀粉。

麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性

海藻糖是一种具有很多功能的非还原性二糖,在生物制品和食品等行业中具有较广泛的用途.对来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12海藻糖酶转化过程中的关键酶基因--麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因进行了遗传密码子的人工改造,合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量,然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,筛选出重组载体并将其导入巴斯德酵母(Pichia pastoris)细胞进行重组表达以用于海藻糖的酶转化.最后获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株,分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800U/mg(蛋白质),该重组菌株遗传稳定率达84%以上,为工业化酶法生产海藻糖奠定了一定基础.

海藻糖合成酶产生菌的筛选及生物合成途径的初步验证

从温泉土壤分离得到11株菌株,它们的胞内释放物能将淀粉转化成海藻糖.对菌株WX-10内含物将淀粉转化为海藻糖的途径进行了初步验证,证明其胞内含有麦芽糖基海藻糖生成酶(MTSase)和麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase).

多酶催化制备海藻糖及分离提取工艺优化

以麦芽糊精为原料,利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)制备海藻糖。探究双酶法转化制备海藻糖以及复合卷式纳滤膜分离纯化海藻糖的工艺条件。结果表明当底物浓度200 g/L麦芽糊精,普鲁兰酶5 U/g麦芽糊精,MTSase 95 U/g麦芽糊精,MTHase 35 U/g麦芽糊精,转化温度60℃,pH 6.0,转化48 h,经糖化后海藻糖转化率达到74.7%;纳滤分离海藻糖时,当加水倍数为5、浓缩倍数为2时,采用连续式操作进行纳滤分离海藻糖效果最佳。

海藻糖生产过程中产酶发酵条件的研究

研究了产酶的培养基组分和比例以及最佳培养条件对微球菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶 (MTHase)的影响 ,得到最优培养基组成为 :葡萄糖 2 .0 % ,酵母膏 2 .0 % ,蛋白胨 1.0 % ,磷酸氢二钾 0 .1% ,硫酸镁 0 .0 5 % ;优化后的培养条件为 :以15 %的接种量接种至 2 5 0mL的锥形瓶中 ,装液量为 5 0mL ,初始 pH值 7.5～ 8.5 ,培养温度为30℃ ,摇床培养 4d。经优化后菌体干重由原来的 1.938g/L增加到 18.5 g/L ,生物量几乎增长了 10倍 ;而酶活也由原来的 30 .6 4U / g增加到 2 0 6 .11U / g ,酶活提高了接近 7倍。

两种制备海藻糖的生物酶转化工艺技术

海藻糖作为具有特殊生物保护功能的非还原性双糖,被广泛应用在食品、医药等各个领域。以双酶法和单酶法为代表的生物酶转化技术是制备海藻糖的研究热点。双酶法以淀粉为原料,在低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶的协同作用下,将直链淀粉转化成海藻糖。双酶法具有原料便宜易得、工艺较成熟、转化率较高等优点,是最早实现酶法工业化生产海藻糖的方法。单酶法直接利用海藻糖合酶将麦芽糖转化为海藻糖。单酶法因为具有反应过程易控、工艺流程简单、副产物少等优点而受到广泛关注。提高酶的耐高温性能及转化效率是目前2种方法的主要研究方向。随着蛋白基因工程领域的发展,生物酶的优化构建技术日趋成熟,为双酶法的进一步完善和单酶法的工业应用奠定了基础。

以淀粉为原料双酶法生产海藻糖的研究进展

双酶法生产海藻糖是指以淀粉为原料,在低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶两种酶的协同作用下,将一定链长的直链淀粉转化成海藻糖的技术。双酶法作为最早实现工业酶转化生产海藻糖的方法,起源于日本,具有原料便宜易得、工艺较成熟、不需要高能量化合物等优点。文章重点介绍了双酶法在国外(尤其是日本)及国内的发展及应用。随着生物基因工程技术的发展,越来越多性能优异的低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶被提取、优化和构建,为双酶法工艺的进一步完善和工业化提供了可能。

硫矿硫化叶菌MTSase和MTHase基因的克隆与表达

从嗜热硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)ATCC35092的基因组中用PCR方法扩增得到编码MTSase和MTSase的基因,分别将其插入原核表达载体pTrc99a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达。MTSase和MTHase酶活产率达到了31·3U/g(wetcell)和403U/g(wetcell)。在75℃,pH5·0条件下,两酶联合作用转化淀粉生产海藻糖,当淀粉浓度为15%,DE值为10时,海藻糖转化率最高为53·6%。

MTSase和MTHase在Brevibacillus brevis中的克隆表达及应用研究

为实现将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)ATCC 33909的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)在短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中的重组表达,分别以重组质粒pET-24a(+)-treY和pET-24a(+)-treZ为模板PCR扩增得到MTSase和MTHase基因片段,通过与表达载体pSVN连接得到重组质粒,电转化表达宿主Brevibacillus brevis,成功构建重组菌Brevibacillus brevis/pSVN-treY和Brevibacillus brevis/p SVN-treZ。重组菌在TM培养基中发酵48 h,胞内酶活力分别达到MTSase 630.0 U/g(wet cell)、MTHase 170.0 U/g(wet cell)。对重组MTSase和MTHase进行酶转化实验,结果表明,当以质量浓度为100 g/L马铃薯淀粉为底物,酶转化温度为60℃,pH为5.5,加酶量为MTSase 80 U/g淀粉、MTHase 20 U/g淀粉,普鲁兰酶5 U/g淀粉和环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)15 U/g淀粉,反应48 h,海藻糖转化率达到80.2%。

藤黄微球菌海藻糖生物合成基因的克隆与鉴定

首次从一株能利用淀粉产生海藻糖的藤黄微球菌中克隆了海藻糖生物合成基因。采用PCR方法结合非随机鸟枪法得到藤黄微球菌中低聚麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)基因(MtreY)的全序列及低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)基因(MtreZ)的部分序列,其中MtreY共有2,370个碱基,编码789个氨基酸,表达产物分子量为86·7kD。同源性分析表明,与已报道的MTSase和α-淀粉酶家族成员具有相同的保守模体。将MtreY基因在大肠杆菌JM83中表达,证明表达产物具有预期的酶活性。

定向进化提高来源于Arthrobacter ramosus的MTHase的热稳定性

麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltosyltrehalose hydrolase,MTHase)是以淀粉或麦芽糊精为底物制备海藻糖的关键酶之一。来源于Arthrobacter ramosus的MTHase,表达量好,比活高,但热稳定性差,限制了其工业化应用。采用定向进化技术,筛选得到L137M和A216T两个突变体,在60℃下,野生型和两个突变体的半衰期(t1/2)分别为15.5、20.5和23.3 min,L137M和A216T的t1/2分别比野生型提高1.3和1.5倍。进一步考察了L137M、A216T和野生型酶在60℃分别和同样来源于Arthrobacter ramosus的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltosyltrehalose synthase,MTSase)复配制备海藻糖,在相同的加酶量下,野生型、L137M和A216T的海藻糖转化率分别为51.3%,52.6%和55.7%,两个突变体的转化率都比野生型提高,说明突变体提高的热稳定性有利于海藻糖的转化率。

TreY-TreZ途径高产海藻糖菌株的筛选

为筛选能以TreY-TreZ途径合成海藻糖的菌株,对采自鲁山中汤温泉水样、温泉土样及面粉厂附近的土样,经高渗平板高温培养,以碘-淀粉水解圈作为初筛方法,通过TLC及HPLC检测,获得了2株产海藻糖的节杆菌属新菌株,经过初步的途径验证,证实这2株菌均以TreY-TreZ途径生成海藻糖。

启动子工程提高海藻糖生产用酶在地衣芽孢杆菌中的表达

麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltosyltrehalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltosyltrehalose hydrolase,MTHase)是酶法合成海藻糖的关键酶。由于该酶系在天然菌种内产量极低,研究者相继在各种模式微生物中对该酶系编码基因进行表达。为了实现MTSase和MTHase在食品安全级菌株的分泌表达,本研究选择重要工业微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为宿主菌株,以MTSase为报告蛋白,通过对天然启动子进行筛选,发现P_(P2)介导下MTSase的表达量最高,在此基础上利用启动子工程策略构建了一系列串联启动子及合成启动子,发现合成启动子P_(1-P2)在原有P_(P2)基础上将MTSase的表达量提高了37%,该启动子对于MTHase的表达同样具有提高作用,在P_(1-P2)介导下MTHase的表达量较在P_(P2)介导下的提高了10%。在发酵培养基和P_(1-P2)启动子介导下MTSase和MTHase的酶活力分别可以达到6907.9 U/mL和798.5 U/mL。