麦芽糖淀粉酶抑制淀粉质食品回生的研究进展

淀粉回生是淀粉质食品在贮藏过程中发生品质劣化的常见现象。麦芽糖淀粉酶属于糖苷水解酶家族13(NPase或CDases子家族)的20亚家族之一,因其在工业和商业领域中的广泛应用而备受关注。目前,麦芽糖淀粉酶广泛应用于面包、蛋糕等焙烤产品的生产中,在面包、蛋糕贮藏过程中起到保持其柔软和弹性的作用,极大地延长了面包产品的货架期,但在其它领域的应用还未得到深度开发,应用领域有待进一步拓展。研究表明,将麦芽糖淀粉酶添加到淀粉质食品中,可以安全有效地抑制淀粉回生,且不易引起化学污染。本文介绍了麦芽糖淀粉酶的结构和作用机理、淀粉老化回生机理以及麦芽糖淀粉酶对不同淀粉质食品回生特性的影响,对开发新型抗老化产品具有一定的参考意义。

麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶D246A异源表达及性质表征

以大型真菌灵芝中的麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(MGAM)为研究对象,采用同源序列比对、同源模建、底物对接和定点突变等方法成功构建酶活力显著降低的突变体D246A.酶学性质表征结果表明:最适反应温度由野生型(wild type,WT)的65℃减少至60℃,突变体耐热能力下降;最适pH值由WT的6.0升高至7.0,有利于工程菌生长;半衰期由WT的2.0 h下降至1.5 h,酶稳定性降低.酶动力学结果表明:突变体D246A酶动力学曲线符合Michaelis方程,与WT相比,K_(m)值变大,表明酶与底物亲和力下降;V_(max)约降低至原来的1/4.

基于麦芽糖诱导型启动子在枯草芽胞杆菌中异源表达麦芽四糖淀粉酶及其酶学性质的研究

麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase,Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以其为核心酶的麦芽四糖生物转化过程的生产成本具有迫切的现实需求。本研究将源自Pseudomonas saccharophila(DSM 654)的麦芽四糖淀粉酶基因mta在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中重组表达,利用麦芽糖诱导型启动子实现其安全高效表达,之后对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,将携带麦芽糖诱导型启动子Pglv的表达载体转入B.subtilis WB800N中,成功构建工程菌后进行诱导表达,并且利用金属离子螯合层析技术成功获得了Mta纯酶。酶学性质研究结果显示其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5。动力学常数Km为(1.26±0.17)g/L、kcat/Km为(2275.07±32.83)L/s·g,纯酶在4℃储存14 d后保留40%的酶活力。本研究成功构建出安全、高效表达重组麦芽四糖淀粉酶的表达系统,为其规模化制备和应用提供了新策略。

Bacillus sp.B110胞内麦芽糖淀粉酶基因克隆与酶学特性

目的:对菌株Bacillus sp.B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL进行基因克隆、异源表达、纯化及酶学性质研究,为后期开发新的淀粉加工用酶打下基础。方法:使用PCR技术对Bacillus sp.B110的胞内麦芽糖淀粉酶bmal基因序列进行全长克隆,异源表达,使用Ni2+-NTA进行纯化,再对其酶学特性进行测定,使用序列分析工具BioEdit、MEGA等对其氨基酸序列进行分析,使用AlphaFold2对其三级结构进行预测分析。结果:BMAL基因全长1770 bp,编码一个589氨基酸残基的蛋白。重组酶rBMAL经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量大小为63 kDa。氨基酸序列分析和三维建模表明BMAL与来源于B.subtilis 168和B.subtilis SUH4-2的麦芽糖淀粉酶有较高的一致性,且BMAL具有一个麦芽糖淀粉酶所独有的N端结构域以及由Asp328-Glu357-Asp424三个氨基酸残基所构成的催化中心。重组酶rBMAL最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.0。重组酶rBMAL在30℃条件下保藏7 h残留酶活为60%,但在60℃条件下保藏2 h残留酶活力下降98%,说明BMAL对热敏感。重组酶rBMAL在4℃,pH7.0~9.5保藏12 h活性稳定。当存在1 mmol/L的金属离子Mg2+时,重组酶rBMAL活力提高36%,而Ni2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Ca2+对重组酶rBMAL有抑制作用,酶活力减少85%~48%。有机溶剂和化学试剂甲醇、乙醇、丙酮、异腈、EDTA和SDS对重组酶rBMAL有较强的抑制作用,酶活力减少至32.3%~64.8%。底物特异性实验结果证实BMAL最适底物为环精糊。结论:Bacillus sp.B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL具有良好的催化特性和pH稳定性,在面包烘焙工业上具有潜在的应用价值。

麦芽糖淀粉酶对面包抗老化的应用研究

我国烘焙行业发展较快,面包品种层出不穷。面包随着放置时间变长会发生淀粉老化的问题,影响面包的口感和销售。本文分析了面包变干老化的原因,研究了麦芽糖淀粉酶作用温度、作用机理,旨在深入探析麦芽糖淀粉酶在面包烘焙中的作用。

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。

产碱菌麦芽四糖淀粉酶水解淀粉的特性

产碱菌麦芽四糖淀粉酶水解不同来源淀粉的产物组成有差异:G4占81.5％～98.8％,G_3占0％～9.6％,G_2占0％～5.9％。不同淀粉的水解速度在4170～9036mgGlch^-(1)·mg^(-1)之间。对可溶性淀粉的水解产物为6-型。麦芽四糖淀粉酶能被小麦、玉米及马铃薯的生淀粉吸附,其吸附率分别为60.2％、50.0％及52.2％,相对水解率分别为4.5％、2.7％及0％,水解生淀粉的主要产物为G_4。

麦芽四糖淀粉酶的晶体培养及初步衍射研究

麦芽四糖淀粉酶是水解方式独特、其产物又具有较广泛应用价值的一种淀粉酶。应用悬滴汽相扩散法，用从产碱菌发酵培养液分离纯化得到的麦芽四糖淀粉酶成功地培养出了质量较好的单晶体。测得该种晶体属正交晶系，空间群为Ｐ２１２１２１，晶胞参数ａ＝４６．６Ａ。，ｂ＝６５．８Ａ。，ｃ＝１７０．９Ａ。，一个不对称单位含一个麦芽四糖淀粉酶分子。用ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈＩＰ面探测器收集了一套分辨率高于２．７Ａ。的衍射强度数据。

麦芽糖淀粉酶在全麦面包保鲜中的应用

将麦芽糖淀粉酶应用于全麦面包的制作,研究不同添加量的麦芽糖淀粉酶对全麦面包的保鲜影响.结果表明,与未添加酶制剂的对照组面包相比较,实验组面包的烘焙品质明显改善,比容和感官评分显著提高;在不同的储存条件下,实验组面包的水分含量下降较慢,感官品质保持较好.

褐色喜热裂孢菌Thermobifida fusca产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍亲和层析对菌株JM109/pSE380-tfa表达的α-淀粉酶进行纯化,SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为64ku,K m值为1.305mg/mL,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0;检测到菌株JM109/pSE380-sptfa的培养基上清有相当一部分酶活。本研究麦芽糖α-淀粉酶与可溶性淀粉反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。因此麦芽糖α-淀粉酶在生产高麦芽糖浆上起到了一定的作用。

用麦芽四糖淀粉酶生产麦芽四糖

采用麦芽四糖淀粉酶，以可溶性淀粉为底物进行了包括温度、ｐＨ值、反应时间、加酶量等多种产糖条件的试验，得到了较理想的反应参数。所得产品麦芽四糖占总糖的比例达８０％以上，转化率为５５％左右。

产碱菌麦芽四糖淀粉酶多型性的形成

产碱菌培养液的酶谱呈一主带Ｇ４Ａ１及两次带Ｇ４Ａ２与Ｇ４Ａ３，分别进行纯化并鉴定其水解产物，均为麦芽四糖，说明三者全是麦芽四糖淀粉酶，它们以多型性形式存在于产碱菌培养液中。培养液中没有检出糖苷酶，２４，７２，９６ｈ培养液中不含蛋白酶（仅４８ｈ培养液中有微量蛋白酶），说明多型性不是糖苷酶和蛋白酶造成的。改变培养条件不影响多型性产生。

地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定

以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板，PCR扩增出1．7kb大小的麦芽糖淀粉酶基因amyM，克隆入表达载体pET-28a（＋），转化Escherichia．coliBL21（DE3），经IPTG诱导，测定麦芽糖淀粉酶酶活性．结果表明，麦芽糖淀粉酶基因amyM获得了活性表达，酶活力为3．797U／mL，SDS—PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为67×10^3的特异性蛋白质条带．酶学性质分析表明，重组麦芽糖淀粉酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH为6．5，在45℃以下的中低温环境保持稳定，且能在比较宽的pH范围内（pH4．5～8．5）稳定．

嗜糖假单胞菌麦芽四糖淀粉酶的枯草芽孢杆菌表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是淀粉酶中第3种外切型酶,可以顺序地从淀粉非还原性末端依次切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。该研究采用含有P43启动子和SacB信号肽的pWB980枯草芽孢杆菌表达载体,连接嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖淀粉酶基因,获得了重组菌pWB980-G4/1A747,实现了麦芽四糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的外分泌表达,并具有生物学活性。对表达产物进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶可广泛作用于7种不同来源的淀粉,生成单一产物麦芽四糖。最适反应温度为50℃,最适pH为7.0。进一步对pWB980-G4/1A747菌株进行发酵条件优化,得到其最佳活化时间为5 h,接种量为5%(v/v),通气量为20 mL/150 mL,培养时间为24 h,培养温度为37℃。

重组Bacillus subtilis产麦芽四糖淀粉酶的发酵优化及麦芽四糖制备

麦芽四糖淀粉酶可水解淀粉或麦芽糊精生成麦芽四糖,在食品领域有着广泛应用。为降低生产成本,对前期构建的生产麦芽四糖淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌进行发酵优化。通过对培养基的氮源和碳源进行优化,以5%的接种量,在33℃、200 r/min条件下发酵48 h,发现以25 g/L豆粕粉和25 g/L工业蛋白胨为氮源,5 g/L甘油为碳源时,重组酶酶活力最高可达236 U/m L。利用发酵所得重组麦芽四糖淀粉酶制备麦芽四糖并进行酶反应条件优化,使用高效液相色谱检测产物含量。发现当酶转化反应温度为50℃,反应p H为7. 0,加酶量为30U/g底物,底物麦芽糊精的质量浓度为250 g/L时,反应12 h,麦芽四糖转化率可达73. 2%,为降低生产成本和工业制备麦芽四糖提供了理论依据。

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。

麦芽四糖淀粉酶晶体的分子堆积学研究

用悬滴汽相扩散法生长了从产碱菌中分离纯化得到的麦芽四糖淀粉酶的晶体 ,并在MarRe search面探测器上收集了一套2.7埃分辨率的衍射强度数据。用分子置换法解得了该种晶体的结构。在此基础上 ,分析和比较了两种不同麦芽四糖淀粉酶晶体中的分子堆积和作用 ,对影响蛋白质晶体分子堆积的一些因素进行了讨论。

Thermobifida fusca麦芽三糖淀粉酶的重组表达及其在麦芽三糖制备中的应用

麦芽三糖淀粉酶以淀粉或麦芽糊精为原料,可生产麦芽三糖,在食品、饮料等行业具有广泛的应用前景。实验将Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌WS11中进行重组表达,并进行酶学性质分析,重组酶的最适温度和pH分别是55℃和6.0。在此基础上探究了重组酶作用于麦芽糊精生产麦芽三糖的最佳条件。结果表明,以15%浓度的麦芽糊精(DE 5-7)作为底物时,酶转化的最佳条件是温度55℃、pH 5.5、加酶量60 U/g(底物)、普鲁兰酶加酶量32 U/g(底物)、反应时间11 h,此时得到麦芽三糖转化率44.4%。该研究为工业制备麦芽三糖提供了理论依据。

用2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖麦芽糖苷作底物测定总淀粉酶和胰腺淀粉酶

目的 建立一个稳定的单一试剂直接测定总淀粉酶和胰腺α 淀粉酶方法。 方法 用 2 氯 4 硝基苯 α 半乳糖麦芽糖苷 (Gal G2 α CNP)作底物 ,同时用麦芽唾液淀粉酶抑制物直接测定总淀粉酶和胰腺淀粉酶。淀粉酶水解Gal G2 α CNP为半乳糖麦芽糖苷和CNP ,在 4 0 5nm波长测定。 结果 本法不需要其它工具酶 ,延迟相较短 ( <60s) ,线性范围可达 1 0 0 0U/L ,并且试剂的稳定性很好。精密度分析批内CV<2 .2 5% ,总CV <3 .0 5。本法 (Y)与IFCC推荐方法 (X)比较 :r=0 .9997,Y =1 .3 74 5X +0 .0 4。 结论 本法测定体液中总淀粉酶和胰腺淀粉酶活性非常简便和灵敏 ,适用于常规分析。

麦芽糖淀粉酶对面包品质及面团特性的影响

研究枯草芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶对面包品质及面团特性的影响,为深入了解酶制剂在烘焙产品中的作用提供理论依据。本实验主要研究了麦芽糖淀粉酶(添加量0%、0.02%、0.04%和0.06%)对面包比容、质构、贮藏期间面包保水性、质构、感官品质及面团流变学特性的影响。结果表明:面包保水性随麦芽糖淀粉酶添加量的增加而显著提高(P<0.05),而且麦芽糖淀粉酶能显著延缓面团黏度和回生值的增加(P<0.05),改善面团品质。当面包贮藏天数的增加,麦芽糖淀粉酶还能延缓面包硬度和咀嚼性的增加,减缓贮藏期面包品质下降(P<0.05)。其中,添加0.04%的麦芽糖淀粉酶能够明显延缓面包老化,对面团淀粉糊化特性影响较小。面包贮藏第7 d时,能减少水分损失36.92%,保持面包弹性。因此,麦芽糖淀粉酶能够延缓面包老化和面包品质下降。