麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。

褐色喜热裂孢菌Thermobifida fusca产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍亲和层析对菌株JM109/pSE380-tfa表达的α-淀粉酶进行纯化,SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为64ku,K m值为1.305mg/mL,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0;检测到菌株JM109/pSE380-sptfa的培养基上清有相当一部分酶活。本研究麦芽糖α-淀粉酶与可溶性淀粉反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。因此麦芽糖α-淀粉酶在生产高麦芽糖浆上起到了一定的作用。

地衣芽孢杆菌生麦芽糖α-淀粉酶的基因克隆与鉴定

以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板，PCR扩增出1．7kb大小的麦芽糖淀粉酶基因amyM，克隆入表达载体pET-28a（＋），转化Escherichia．coliBL21（DE3），经IPTG诱导，测定麦芽糖淀粉酶酶活性．结果表明，麦芽糖淀粉酶基因amyM获得了活性表达，酶活力为3．797U／mL，SDS—PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为67×10^3的特异性蛋白质条带．酶学性质分析表明，重组麦芽糖淀粉酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH为6．5，在45℃以下的中低温环境保持稳定，且能在比较宽的pH范围内（pH4．5～8．5）稳定．

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。

地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶产麦芽糖特性研究

为了开发新的生产麦芽糖浆的淀粉酶,在大肠杆菌中表达了一个地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)麦芽糖α-淀粉酶,并对该酶产麦芽糖的特性进行研究。结果显示,重组酶分子大小为65kDa,以淀粉为底物的最适温度为45℃,最适pH值为6.5。以浓度为20%的可溶性淀粉为底物,加入106U/g淀粉的地衣芽胞杆菌麦芽糖α-淀粉酶,反应48h,采用HPLC检测产物,产物中只有葡萄糖和麦芽糖,其中麦芽糖含量为52.21%,还原糖得率为72.1%;当加入1U/g淀粉的普鲁兰酶协同作用进行反应时,产物中麦芽糖的含量增加到57.16%,还原糖得率增加到92.5%。该酶在麦芽糖浆的工业生产上有较大的潜在应用价值。

真菌α-淀粉酶和麦芽糖α-淀粉酶对馒头粉品质改良的比较研究

从提高小麦粉质量、延长馒头货架期的角度出发,以国产小麦粉作为试验用粉,通过粉质试验、降落数值测试、蒸馒头试验及质构测试等分析方法,研究了真菌α-淀粉酶和麦芽糖α-淀粉酶在国产小麦粉中发挥改良作用的应用效果。结果表明:真菌α-淀粉酶对馒头粉综合品质的提高优于麦芽糖α-淀粉酶,而麦芽糖α-淀粉酶在馒头贮存过程中的抗老化效果优于真菌α-淀粉酶。

不同酶处理对多孔大米淀粉性能的影响

使用麦芽糖α-淀粉酶(MA)和淀粉葡糖苷酶(AMG)分别处理制备多孔大米淀粉,对其表征特性进行对比分析。通过扫描电镜可知,这两种酶均使淀粉颗粒表面产生蜂窝状多孔结构。经酶处理的大米淀粉颗粒的相对结晶度(25.54%~33.26%)均高于天然淀粉的相对结晶度(23.74%)。MA处理增加了短支链淀粉链的数量,并且随着酶处理时间的延长降低了分子质量。与对照组相比,MA和AMG处理的淀粉颗粒溶胀度、表观直链淀粉含量、峰值黏度、崩解值、最终黏度和回生值均下降。MA处理的淀粉颗粒具有更高的溶解指数(1.46%~2.57%),AMG处理的淀粉颗粒的溶解指数均小于0.42%。与对照组相比,经酶处理的大米淀粉糊化温度会延迟0.8~6.0℃,焓变增加范围在1.0~3.8 J/g。