麻牛膝TONSOKU基因克隆、生信分析及其抑菌作用

目的克隆编码麻牛膝(Cyathula capitata(Wall.)Moq.)CcTSK蛋白的基因全长,通过基因重组技术制备表达质粒,对表达产物进行生物学预测和抑菌分析。方法以麻牛膝嫩叶为材料,完成CcTSK基因cDNA的克隆。采用生信软件分析该基因及编码蛋白的生物学特征。构建CcTSK基因原核表达载体,并转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态中,IPTG诱导表达,考察CcTSK-GST融合蛋白的表达菌株对低浓度抗生素的敏感性、自身生长变化及在较高浓度抗生素下的存活率。结果CcTSK基因的gDNA为12613 bp,CDS为3855 bp,共编码1284个氨基酸。CcTSK蛋白为亲水性不稳定蛋白,没有跨膜结构域,属于没有信号识别功能的非分泌蛋白,亚细胞定位预测该蛋白可能位于细胞核,并且具有核定位信号,含有TPR重复序列与LRR重复序列结构域,二级结构主要有α-螺旋(占53.89%)、无规卷曲(占32.79%)、延伸链(占8.88%)和β-转角(占4.44%)。经IPTG诱导后,CcTSK-GST融合蛋白的表达抑制大肠埃希菌生长。低浓度抗生素测试结果显示,CcTSK-GST表达菌株对氯霉素(chloramphenicol,Cam)最敏感;高浓度抗生素处理下,CcTSK-GST的表达使得抑菌现象显著增强。结论成功获得编码CcTSK蛋白的基因全长及原核表达质粒,并对其生物学特征进行了分析比较,该蛋白与拟南芥AtTSK蛋白有较高相似性。此外,CcTSK-GST融合蛋白的表达对大肠埃希菌增殖具有抑制作用,并且显著增强抗生素所产生的抑菌现象。

川牛膝与麻牛膝的鉴别

药材川牛膝在使用中常与同科植物麻牛膝发生混用 ,但二者性味不同 ,应加以区别。本文从原植物形态、外观性状、粉末显微鉴定方面对二者进行鉴别比较 ,以利区分使用。

川牛膝、麻牛膝及杂交牛膝多糖的分离、纯化和对猪小肠上皮细胞活性的比较研究

研究旨在比较川牛膝及其常见伪品的多糖含量、组分和对猪小肠上皮细胞活性的差异。用乙醇除杂,水加热回流法得粗多糖;用阴离子交换层析法和凝胶柱层析法分离、纯化多糖,并测定多糖的相对分子量;用CCK-8试剂盒系统测定多糖对猪小肠上皮细胞活性的影响;用荧光定量PCR检测多糖作用后炎症细胞因子IL-6表达情况。试验结果:①川牛膝粗多糖得率为7.40%;麻牛膝粗多糖得率为1.67%;杂交牛膝粗多糖得率为0.38%;②川牛膝酸性多糖得率为94.40%,中性多糖得率为1.10%;麻牛膝酸性多糖得率为30.74%,中性多糖得率为23.00%;杂交牛膝酸性多糖得率为11.20%,中性多糖得率为10.00%;③川牛膝多糖相对分子量主要分布在7 500 Da左右、200 000～400 000 Da和1 200 000～1 700 000 Da;麻牛膝多糖的相对分子量主要集中在7 500 Da左右;杂交牛膝多糖相对分子量主要集中在6 000 Da左右;④川牛膝多糖和麻牛膝多糖的低剂量和高剂量组对猪小肠上皮细胞活性均无明显影响;川牛膝多糖和麻牛膝多糖均能显著抑制炎症细胞因子IL-6的表达。川牛膝多糖含量显著高于麻牛膝和杂交牛膝多糖,川牛膝和麻牛膝多糖对猪小肠上皮细胞活性无明显影响,但均能降低炎症细胞因子IL-6的表达量。

基于ITS序列分析技术鉴定川牛膝与常见伪品麻牛膝

目的:比较川牛膝与其常见伪品麻牛膝之间的ITS序列差异及规律。为川牛膝与麻牛膝的DNA条形码鉴别提供适合的分子标记。方法:收集川牛膝及麻牛膝成品药材并提取纯化其基因组DNA,经PCR扩增得到ITS序列(包括ITS1、5.8S nrDNA、ITS2)并进行T-A克隆后测序,分析两者序列差异。结果:PCR扩增获得两者ITS序列,经多序列对比分析得出川牛膝与伪品麻牛膝的ITS序列存在明显差异。结论:ITS序列分析可以用作鉴定川牛膝与麻牛膝药材。

川牛膝与麻牛膝的形态鉴别

目的鉴别川牛膝与麻牛膝形态特征。方法运用组织切片法和显微电镜观察法,对川牛膝“宝膝1号”与麻牛膝的组织形态进行比较、鉴别。结果川牛膝与麻牛膝在花序、茎、叶片和根部组织形态上有明显差异。川牛膝为主根系植物,茎中有4个维管束,表皮毛数量较多,叶片呈浅绿色,叶绿体发育正常;而麻牛膝为支根系植物,堇中有2个维管束,表皮毛数量较少。此外,麻牛膝叶片在高海拔地区呈深绿色且有大小不规则的黄色斑点,有嗜锇颗粒出现,然而低海拔地区的麻牛膝并无此现象。结论确定了川牛膝和麻牛膝的主要形态特征,并为川牛膝和麻牛膝的鉴别提供科学依据。

川牛膝薄层色谱鉴别方法的优化研究

目的:建立中药材川牛膝薄层色谱鉴别的新方法,为川牛膝的鉴别提供更优方案。方法:对川牛膝及其常见混伪品麻牛膝、杂牛膝、牛膝的薄层色谱条件进行考察,筛选并确定最优条件。结果:从供试品溶液制备、展开剂组成等方面进行了优化,并分别考察了影响薄层色谱效果的温度、湿度、稳定性、专属性等多个因素,建立了一种薄层特征明显、可有效地区别川牛膝及其混伪品的薄层色谱鉴别方法。结论:该方法操作简便,成本低,定性特征明显,重复性好,适用于川牛膝药材的薄层色谱鉴别,且比现有的药典方法效果更佳。

川牛膝及其混淆品的抗炎作用比较

比较4种不同产地的川牛膝及其3种混淆品的抗炎药理作用。采用二甲苯致小鼠耳肿胀和蛋清致大鼠足肿胀炎症模淹,研究川牛膝及其混淆品的抗炎作用。结果显示,板桥、宝兴川牛膝和川牛膝的3种混淆品可减轻二甲苯致小鼠耳肿胀程度和蛋清致大鼠足肿胀程度,且具有明显的量效关系;金口河川牛膝剂量为10g/kg时,可减轻蛋清致大鼠足肿胀程度,表明板桥、宝兴和金口河产川牛膝具有一定的抗炎作用,奉节川牛膝未见有抗炎作用;麻牛膝和"红牛膝"具有明显的抗炎作用。

《医学衷中参西录》中牛膝等四种中药的品种考证

该文考证认为《医学衷中参西录》中所载当时较好的川牛膝应是苋科植物麻牛膝Cyathula capitata(Wall.)Moq.的根;当时市场上"辣胜于甜者"的肉桂应是桂皮,说明当时有用桂皮充肉桂销售药用;古代多家本草记载,当时也在应用的土三七应是菊科植物菊三七Gynura japonica(Thunb.)Juel.的根或全草;张锡纯所用的石膏是生石膏,且鉴别生、熟石膏的方法是科学有效的。

基于皂苷类成分研究鉴别川牛膝及其伪品

目的:改良现行川牛膝质量标准方法的TLC鉴别并新增HPLC-ELSD法,以弥补川牛膝类药材鉴定方法的不足。方法:以川牛膝伪品麻牛膝所含特征性皂苷类成分为线索,依据泡沫实验、TLC鉴别及HPLC-ELSD法建立川牛膝及其伪品的鉴别方法,并对所收集的11批川牛膝、21批麻牛膝及7批杂牛膝样品进行鉴别。结果:泡沫实验中麻牛膝所产生的泡沫最多,其次为杂牛膝,川牛膝最少。TLC鉴别中所有批次的川牛膝均不显与牛膝皂苷Ⅰ、牛膝皂苷Ⅱ对照品相同的黄绿色荧光斑点,且未有与川牛膝对照药材不一致的黄绿色斑点。麻牛膝及杂牛膝与川牛膝结果相反,且杂牛膝的黄绿色斑点弱于麻牛膝。HPLC-ELSD法所建立的麻牛膝指纹图谱与所有批次麻牛膝相似度高,与川牛膝相似度极低,与杂牛膝的相似度不高,且麻牛膝与杂牛膝均存在与牛膝皂苷Ⅰ、牛膝皂苷Ⅱ对照品相同的峰。结论:HPLC-ELSD法使用相似度评价分析并结合是否检出牛膝皂苷Ⅰ、牛膝皂苷Ⅱ峰可作为鉴别川牛膝类药材的一种新的有效鉴别方法,泡沫实验及TLC鉴别可作为其辅助鉴别手段。

川牛膝及其常见混用品鉴别研究

目的:对川牛膝及其混用品进行鉴别研究。方法:采用生药学的常规方法,对川牛膝及其混用品的性状、横切面、粉末进行观察比较。结果:川牛膝、麻牛膝、杂交牛膝在形状、根长、根中部直径、表面特征、质地、断面特征、气、味上有差异。川牛膝、麻牛膝、杂交牛膝的横切面在显微镜下观察可见,三者在维管束环数及每环三生维管束的个数、中央次生构造维管束的大小及个数、薄壁细胞形状、草酸钙砂晶及方晶的含量有所不同。在显微镜下观察川牛膝、麻牛膝、杂交牛膝的粉末可见细微差别。结论:实验结果可为川牛膝及其混用品的鉴别提供参考依据。

基于国家药品抽检的川牛膝质量问题及建议

目的 基于2022年国家药品抽检工作,分析市场上不同厂家川牛膝质量差异,分析问题并提出建议,为川牛膝的质量监管及标准提高提供依据。方法 针对所抽取川牛膝样品按照相应标准进行检测,出具检验报告书。针对检验中所发现的质量问题、标准问题及前期调研发现的相关问题进行有针对性的探索性研究,进行质量评价分析,发现问题,提出建议。结果 共抽取川牛膝样品334批。标准检验,2批样品性状不合格,存在用麻牛膝充当川牛膝使用的情况,同时发现标准收载含量测定方法过于复杂,且限度过低。探索性研究,27批川牛膝检出麻牛膝特有成分牛膝皂苷Ⅰ,7批超出规定限度,存在麻牛膝混用的情况;270批川牛膝检出植物生长调节剂(多效唑)。114批重金属及有害元素镉(Cd)检测超出限度。最后提升了川牛膝质量标准、建立了补充检验方法、提出风险警示。结论 通过此次全国抽检发现川牛膝饮片和标准中的相关问题,提示需完善标准并加强川牛膝的质量监管。

川牛膝及其混淆品活血化瘀作用比较

目的为比较不同产地川牛膝及其混淆品活血化瘀作用的特点。方法采用肾上腺素和角叉菜胶分别对大鼠和小鼠造成血瘀模型,观察水煎液对大鼠血液流变性中的各项检测指标、小鼠尾血栓长度、小鼠微循环的影响。结果血液流变性试验表明四川宝兴、金口河、湖北板桥及重庆奉节产川牛膝和宝兴产红牛膝、四川会东产麻牛膝10 g·kg-1均能明显降低血浆粘度。其中宝兴产川牛膝还具有降低全血粘度、对抗红细胞聚集和提高红细胞变形能力的作用,板桥、奉节产川牛膝也能对抗红细胞聚集,但效果不如宝兴产川牛膝;5 g·kg-1时宝兴、板桥产川牛膝对血浆粘度亦有明显的降低作用。尾血栓试验显示宝兴产川牛膝10,5 g·kg-1皆有明显抑制角叉菜胶所致小鼠尾血栓的作用,金口河产川牛膝仅10 g·kg-1有明显抑制尾血栓的作用,其余5个样品均无明显抑制尾血栓的作用。微循环试验结果表明宝兴、金口河产川牛膝10,5 g·kg-1均能改善小鼠微循环障碍;奉节产川牛膝仅10 g·kg-1能改善小鼠微循环障碍。湖北板桥产川牛膝、宝兴及天全产红牛膝和会东产麻牛膝均无明显改善小鼠微循环的作用。结论 6个样品(除天全产红牛膝外)均有一定的活血化瘀作用,其中川牛膝的活血化瘀作用明显优于麻牛膝和"红牛膝",且宝兴产川牛膝活血化瘀作用最为突出。