汉滩病毒西安分离株84FLi的L片段核苷酸序列测定以及分析

采用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,分节段扩增汉滩病毒 84FLi株的L基因片段cDNA ,纯化的PCR产物片段直接用于序列测定或克隆入 pND18 T载体中进行测序。结果表明 ,84FLi株的L片段cDNA由 6 5 33个核苷酸组成 ,四种核苷酸的比例分别为A33.39% ,C16 .4 3% ,G2 0 .74 % ,T2 9.4 4 %。GC含量为 37.17% ,AT含量为6 2 .83%。推导出的最大开放读码框架为从 38到 6 4 93,共编码 2 15 1个氨基酸。序列同源性分析表明 ,84FLi株核苷酸与HTN型国际标准毒株 76 118的同源性为 83.7% ,差异性为 18.8% ;而与中国株A9的同源性高达 97.6 % ,差异性仅为 2 .4 %。与SEO型代表Seoul80 39的同源性为 75 .2 % ,6 6 .1%～ 6 6 .5 %。L片段的氨基酸比较分析表明 ,L片段与HTN型间的同源性为 97.5 %～ 98.0 % ,而与SEO型的同源性为 83.5 %～ 85 .5 %。与PUC、TUL、SN和AND等其它型汉滩病毒的同源性仅为 6 8.6 %～ 6 9.6 %。结果表明 84FLi株属于HTN型 。

我国SEO型汉坦病毒L基因核苷酸序列测定研究

目的 为各基因型或亚型病毒生物学表型研究打基础 ,对疫苗的选择使用提供科学依据。方法 将获得SEO型病毒分离、MCABS分型RT -PCR扩增及核苷酸序列测定。结果 首次测出我国SEO型病毒部分L基因核苷酸序列 ,并与 76 - 118、C4、L99、Seoul株的核苷酸及氨基酸同源性进行比较 ,分别为 70 8%、72 %、95 3%、95 9%及 75 6 %、75 1%、97 7%、97 3 %。结论 病毒基因组间的重排不是造成发病高峰的原因。

核苷酸序列测定法定量评价病毒相对适合度

目的:评价核苷酸序列测定法定量检测病毒相对适合度的可靠性。方法:用RT-PCR法扩增此前筛选获得的Palivizu mab逃逸株F基因片断(分别于F基因第816位和828位带有区别于原型株的遗传标志)。RT-PCR产物经纯化、定量并调节至相同浓度,按不同比例混合后进行核苷酸序列测定。用ABI公司EDIT软件分析序列双峰部位不同RT-PCR产物所占比例,代表病毒适合度水平,用分子克隆法定量验证序列分析定量评估病毒相对适合度的可靠性。结果:按不同比例预混得RSVA2原型株和Palivizumab逃逸株(MP4和F212)分别在F基因第816位和828位出现双峰。峰高测定所获RT-PCR产物比例与预混比例十分接近。采用分子克隆法获得的RT-PCR产物比例亦与序列测定定量分析结果基本一致。结论:序列测定定量分析法评估病毒相对适合度(Relative fitness)结果稳定可靠,简便易行,适用于临床检测HIV等病毒感染性疾病耐药毒株是否出现及其适合度变化。

口蹄疫病毒株China/99L区段核苷酸序列测定及比较分析

以口蹄疫病毒株China/ 99RNA为模板 ,反转录并扩增目的cDNA ,然后与 pGEM TEasy载体连接并转化JM10 9菌株 ,提取的重组质粒用电泳、PCRampos和EcoR1酶切法鉴定。该毒株与A10、O1K、O1Campos和TW 45毒株的核苷酸序列差异率分别为 15 .2 7%、15 .5 6 %、15 .5 6 %和 15 .49% ;氨基酸序列差异率分别为 8.2 9%、8.76 %、9.2 2 %和 10 .14%。五个毒株的L/P1连接处均为苷氨酸 (Gly) /异亮氨酸 (Ile)。序列比较表明 ,T C、A G和A C转换率较高 ,是点突变的热点核苷酸 ,是影响氨基酸稳定的因素之一。第 43 5 3、95 10 5、10 8 111、146 15 3、16 1 173、183 188和 182 187区域极有可能是L蛋白酶的活性中心 ,第 48位的H、5 1的C、6 5位的E、95位的H、10 9位的H、138位的H、148位的H和 16 5位的E可能是L蛋白酶的活性位点 。

质粒pXZ10145核苷酸序列测定和分析

以Sanger双脱氧中止法为原理,利用美国ABI公司370A自动核酸序列分析仪,我们测定了谷氨酸棒杆菌质粒pXZ10145全长4887bp的核苷酸序列,该质粒上存在包括ApaI等18种限制酶的单一切点,其它限制酶切点的数目和位置也被定出,质粒上有8个可能的阅读框架,通过序列分析,我们确定了pXZ10145断裂生成缺失突变体pNAT65的两侧位点,在两个断裂点上发现存在'ATCTAGC'7个碱基的同向重复序列。

大肠杆菌菌毛抗原K_(99)基因的亚克隆及核苷酸序列测定

利用PCR技术 ,从含有大肠杆菌菌毛抗原K99基因的质粒pX5K中扩增出 0 .4kb的K99菌毛抗原基因 ,然后将其亚克隆到pGEM T easy载体上 ,并转化至受体菌JM10 9中 ,采用碱性裂解法提取质粒DNA后 ,经NcoI和EcoRⅠ双酶切分析和核苷酸序列分析 。

保定地区肾综合征出血热病人血清PCR分型及核苷酸序列测定

为明确保定肾综合征出血热 (HFRS)疫区的型别 ,采用RT PCR方法 ,检测急性期HFRS病人血清的汉坦病毒(HV)RNA ,并进行分型及部分核苷酸序列的测定 ,并与国内外HV的代表株进行比较。结果 31份急性期病人血清经RT PCR分型 ,2 4份为汉城型 (SEO型 ) ,2份为汉滩型 (HTN型 ) ,并测得SEO型C3株M基因 (位于 1985— 2 314位 ) ,HTN型LBY株M基因 (位于 1996— 2 314位 )核苷酸序列与国内外代表株的核苷酸和氨基酸序列相比较 :C3与 76 118、A9、LBY核苷酸同源性分别为 :6 8 79%、6 7 5 8%、6 8 0 3% ;氨基酸同源性分别为 :77 2 7%、77 2 7%、78 3%。C3与Seoul、R2 2相比 ,核苷酸同源性分别为 :95 15 %、93 94% ;氨基酸均为 97 2 7%。LBY与 76 118、A9、Seoul、R2 2核苷酸同源性分别为 :98 75 %、87 15 %、6 8 34 %、6 8 0 3% ;氨基酸同源性分别为 :10 0 %、96 2 3%、78 3%、78 3%。首次发现与韩国 76 118株同型(HTN型 )HV在保定的存在 。

中国株庚型肝炎病毒C感染的检测及其部分核酸序列测定

中国株庚型肝炎病毒Ｃ感染的检测及其部分核酸序列测定国内首次采用合成肽抗原筛查高危人群血液中的庚型肝炎病毒Ｃ（ＧＢＶ－Ｃ）抗体。单采浆站供血者ＧＢＶ－Ｃ抗体阳性率为０．４４％（１１／２５００）；非甲－戊型肝炎患者ＧＢＶ－Ｃ抗体阳性率为６．６７％（２／３...

广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析

目的对广西流行的猪瘟病毒E2基因进行序列测定及分析。方法应用PCR对15株猪瘟病毒E2基因进行扩增、克隆及测序,利用DNAstar分析软件对所测定的15株毒株与兔化弱毒(HCLV)、石门(Shimen)毒株的相应基因片段进行同源性分析。结果得到长度为1092nt猪瘟病毒E2基因,编码364个氨基酸残基的目的基因片段。广西株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.5%～82.8%和82.8%～84.3%,推导的氨基酸同源性分别为87.1%～88.8%和88.5%～89.9%,广西毒株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为92.3%～99.9%和94.8%～100%。广西15株猪瘟病毒E2蛋白上的全部半胱氨酸(Cys)位点均未改变,推测其E2蛋白的抗原结构保持很高的稳定性。但广西毒株中与特定单克隆抗体结合的724、725、729、734和738位的氨基酸发生了变异,这些变异可能导致不完全免疫保护。把所测定的广西15株与国内外已发表的19株病毒相应序列进行比较,建立系统发育树,所比较的34株猪瘟病毒被分为两个群,广西毒株皆属于基因群Ⅱ。结论成功进行了广西流行猪瘟病毒E2基因序列分析,为进一步探讨猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构提供了依据。

辣椒温和斑点病毒(PMMV)外壳蛋白基因的克隆和序列测定

从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA。根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2,用RT-PCR扩增PMMV-QD的CP基因的cDNA,插入pMD18-T载体,转化感受态受体菌XL1-Blue,以蓝白菌落筛选转化株,用PCR检测白色菌落,确认获得了含cDNA的阳性重组子。序列测定和比较的结果表明该片段确含有PMMV的CP基因编码区,此种cDNA与国外报道的PMMV病毒株系核苷酸序列的同源性达到97.7%。

鸡传染性支气管炎病毒M41及疫苗株H52,H120 S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列,设计了一对引物并以RT PCR特异性扩增出IBV标准强毒株M41和疫苗株H52,H120的S1基因,基因产物大小为1.62kb,与预期相符.对其测定序列后,同源性比较显示M41株与H52,H120的核苷酸序列的同源性分别为99.2%和97.1%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.3%和95.4%.该结果表明IBVM41与疫苗株H52,H120在S1基因上具有高度的同源性.

一株长春地区戊型肝炎病毒全基因cDNA序列测定

我国报道的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus HEV)基因组序列,大多数为散发型HEV部分基因序列的测定,仅少数为全基因序列的分析结果,而且,各实验室所分析的HEV片段不同,因此,很难确定新型变异株,远远不能满足中国基因分型的研究和临床诊断的需要.为此,我们对长春地区一株散发性HEV进行了全基因cDNA序列测定.

赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因的体外扩增、分子克隆、核苷酸序列分析及其编码33kDa内鞭毛蛋白对BALB/c小鼠的兔疫/保护作用

戴保民教授于1986年任博士导师,1981～1987年任卫生部医学科学委员,1986～1993年任国际细菌学会钩端螺旋体命名委员会协作委员,1992～1997年任卫生部自然疫源性疾病专家咨询委员,1990年获卫生部科技进步一等奖,1992年获国家科技进步三等奖。

山东地区输血后丙肝患者HGV感染状况及HGV部分核酸序列测定

目的 了解山东地区输血后丙型肝炎 (Post transfusedhepatitisC ,PTH C)患者庚肝病毒 (hepatitisGvirus,HGV)感染的状况及HGV部分基因核苷酸序列。方法 应用RT PCR法检测HGVRNA ,并对阳性扩增的产物采用PCR技术片段直接克隆法测定。结果 从 86例PTH C患者血清中检出HGVRNA阳性者 31例 (36 % ) ,其中一例患者HGVNS5区部分核苷酸序列与美国原始株 (u44 40 2 )和另一例日本株 (d872 5 5 )核苷酸同源性比较分别为 86 %和 84%。结论证实山东地区PTH C患者存在着HGV感染和HGV HCV混合感染 ,是否该地区存在着不同亚型或HGVRNA阳性携带者 ,有待进一步证实。

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)S1基因序列 ,设计了一对引物并以RTPCR特异性扩增出IBVH5 2疫苗株的S1基因 ,基因产物大小为 1.62kb ,与设计相符 .对其进行序列测定后 ,与其他标准毒株H12 0 ,M 41,BEAU株的S1基因进行同源性比较 ,结果表明 ,H5 2株与H12 0 ,M 41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为 91.1% ,96.9%和 96.8% ,由此可以看出 ,IBVH5

麻疹病毒CC-47株非编码区核苷酸序列测定与比较

目的 测定麻疹病毒疫苗株长 47(CC 47)的非编码区核苷酸序列 ,并和其他麻疹病毒比较 ,为利用疫苗株病毒进一步研究奠定基础。方法 用RT PCR分段扩增并克隆麻疹病毒CC 47株基因组全序列 ,用基因特异引物测定非编码区的核苷酸序列。结果 CC 47疫苗株非编码区在基因组上为 7个不连续的片段 ,总计 1791个核苷酸。与其他野毒株及Edmonston衍生 5株疫苗株非编码区序列比较发现 ,CC 47疫苗株具有与Edmonston疫苗株系列相同的 4个特征性的核苷酸替代位点 ,分别位于基因组 3′末端第 2 6位 (U→A)、42位 (U→G)和M F基因间隔区FmRNA 5′非翻译区的 4978位(A→G)、5 34 9位 (A→G) ,这些位点的改变可能会影响病毒mRNA的合成、加工和翻译效率以及基因组的复制和包装。结论 不同基因型麻疹病毒具有同样的位点改变可能与病毒在半许可细胞中适应或减毒有关 。

侵染广州番木瓜的曲叶病毒DNA-A分子特征及生物学测定

从中国广州番木瓜上检测获得双生病毒分离物GT,核苷酸序列测定表明,GT分离物DNA-A全长2769个核苷酸,编码6个ORFs,其中病毒链编码AV1(CP)和AV2两个ORFs,互补链编码AC1～AC4四个ORFs。DNA-A全序列、基因间隔区核苷酸序列及各ORF编码的氨基酸序列比较表明,GT与广东番木瓜曲叶病毒分离物GD2亲缘关系最近(96.7%)。生物学初步测定表明,该病毒可通过烟粉虱(Bemisiatabaci)传播到番木瓜、烟草和番茄植株上。

猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

从确诊为猪附红细胞体感染的猪场,无菌采集血样,抽提猪附红细胞体基因组DNA,采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因扩增,对扩增产物进行克隆和测序。从3 个地理位置不同的猪场均成功地扩增出长度为1 469 bp的核苷酸序列。系统进化分析表明,3个猪场样品所测序列一致性达99 52%以上,具有相同的基因型,但与国外报道的猪附红细胞体Illinois株同源性为95%,属于同一基因群,但基因型不同;所有种类的附红细胞体和血巴尔通氏体组成同一进化分支,这类血营养菌与支原体科,支原体属的病原最靠近(75%),而与立克次氏体目的病原较远(70%)。上述研究证实,广东所流行的猪附红细胞体是一种新基因型的猪附红细胞体,建议命名为猪附红细胞体广东株型;为反映进化关系,猪附红细胞体和其它血营养菌应划归于支原体科的支原体属。