麻疹疫苗生产用毒株沪191增殖的动力学研究

通过延长麻疹病毒生产中感染的基质细胞培养时间并连续收获病毒,获得麻疹病毒生产的动力学曲线;通过工艺放大阶段的病毒增殖动力学研究,提高麻疹病毒产量。采用直接接种和间接接种法,接种不同感染量（MOI）的病毒,将转瓶培养单次收获改为转瓶培养多次收获,滴定整个培养期间每次收获液的病毒滴度,观察感染的细胞培养维持状况并计算病毒产量。结果表明,直接接种病毒培养期为20-25d,共收获病毒14-17次;间接接种病毒培养期24d,共收获病毒29次。通过延长感染细胞培养时间和连续收获病毒,获得病毒繁殖的动力学曲线。通过麻疹毒株的增殖动力学研究获得了麻疹疫苗生产毒株沪191增殖动力学相关参数。

麻疹病毒疫苗株沪_(191)和宁波麻疹病毒流行株血清交叉中和试验结果分析

目的分析麻疹病毒疫苗株[上海(沪)191,Shanghai191;S191]的免疫保护性,为探讨有效预防控制麻疹的措施提供参考。方法用微量中和试验测定不同人群血清对麻疹病毒疫苗株(S191)和浙江省宁波市麻疹病毒流行株(Ningbo2008-06)的中和抗体(Neutralizing Antibody,NA)水平。结果 S191株麻疹减毒活疫苗(Measles Attenuated Live Vaccine,MV)初次免疫(初免)血清,有MV免疫史麻疹患者急性期血清,麻疹患者恢复期血清,应急接种MV前、后血清,对疫苗株的NA几何平均滴度(Geometric MeanTiter,GMT)分别为1∶35.23、1∶4.16、1∶231.74、1∶37.81、1∶61.03;对麻疹病毒流行株的NAGMT分别1∶19.04、1∶2.21、1∶596.62、1∶32.25和1∶67.54。初免血清及有免疫史麻疹患者急性期血清,对疫苗株的NAGMT分别是流行株的1.85倍(t=2.537,P<0.05)和1.88倍(t=-2.696,P<0.05);麻疹患者恢复期血清对流行株的NAGMT是疫苗株的2.57倍(t=-3.054,P<0.05);而应急接种后血清中和疫苗株和流行株的NAGMT差异无统计学意义。小月龄婴儿血清随着月龄增长对疫苗株和流行株的NAGMT均下降,6月龄和8月龄婴儿对流行株的NAGMT分别为1∶2.60和1∶1.24。结论 S191株MV能中和宁波麻疹病毒流行株,只是中和能力略有下降;应急接种能显著增加麻疹NA水平;母传麻疹抗体6月龄后几乎无保护作用;有必要对现行MV免疫策略进行调整。

麻疹IgG抗体EIA检测试剂盒的研制及应用

【目的】研制检测麻疹IgG抗体的酶联免疫（EIA）试剂，用于确定人群免疫状况、考核麻疹疫苗接种效果及辅助诊断麻疹病毒的感染。【方法】以经超滤、PEG沉淀和蔗糖密度梯度超速离心纯化后的沪191株麻疹病毒为包被抗原，经试验确定EIA检测的最佳反应条件，最终建立麻疹病毒IgGEIA检测试剂盒，并与血凝抑制实验（HI）及SIGMA麻疹IgGEIA检测试剂盒作比较。【结果】纯化后沪191株麻疹病毒的比活性为775．76HAU／mg，以该纯化抗原制备的EIA检测试剂盒的检测下限为12．5mlU／ml，具有良好的线性（r=0．997）和重复性（CV为4．72％～13．51％）。4℃放置6个月、37℃放置3d，该试剂的灵敏度不变，说明其具有良好的稳定性。与血凝抑制实验（HI）相比，该试剂的灵敏度为99．46％，特异度为81．82％，一致性为97．58％，与SIGMA麻疹IgGEIA诊断试剂盒的一致率为95．12％。【结论】该检测试剂盒可以正确评价人体麻疹免疫状况，为流行病学调查提供了一个可靠、客观、灵敏和快速的手段。

麻疹IgM EIA检测试剂盒的研制

目的研制检测麻疹IgM抗体的酶联免疫（EIA）试剂盒。方法以经超滤、PEG沉淀和蔗糖密度梯度超速离心纯化后的沪191株麻疹病毒为包被抗原，经试验确定EIA检测的最佳反应条件，最终建立麻疹病毒IgM EIA检测试剂盒，并与HUMAN麻疹IgM EIA检测试剂盒作比较。结果经Western—blot证明，纯化后沪191株麻疹病毒特异性符合要求。以该纯化抗原制备的EIA检测试剂盒具有良好的重复性（CV为4．76％～11．96％）。4℃放置6个月、57％放置3d，该试剂的灵敏度不变，说明其具有良好的稳定性。与HUMAN试剂盒相比，该试剂盒的灵敏度为94．12％，特异度为92．31％，一致性为93．91％。结论沪191麻疹IgM诊断试剂可以正确反应麻疹病毒的感染情况，可以作为一种可靠、简便、快速诊断麻疹病毒感染的实验室方法。

表达2型登革病毒NS1重组麻疹病毒的拯救及鉴定

以麻疹病毒沪-191疫苗株(MVS191)为载体构建表达2型登革病毒非结构蛋白NS1(DENV2NS1)的重组麻疹病毒。将编码DENV2NS1 6×His蛋白的核酸序列用Bsi WI和BssHII酶切位点插入至载体pT7-MVF23ATU上,然后构建载体pT7F123DENV2NS1 6×His,最后构建获得插入了外源基因DENV2 NS1 6×His的载体pT7MVS191-DENV2NS1 6×His。质粒pT7MVS191-DENV2NS1 6×His与表达麻疹病毒N、P、L蛋白的辅助质粒共转染BSRT7细胞完成病毒包装后,在Vero细胞内增殖,完成重组病毒的拯救。重组病毒在Vero细胞上传至第4代,基因测序证明重组病毒中成功插入了外源基因DENV2NS1 6×His;Western Blot、原位免疫荧光反应可检测到重组病毒中麻疹病毒N蛋白及外源抗原DENV2NS1 6×His的表达;重组病毒增值特性与疫苗株MVS191相似;P1至P4代的重组病毒滴度稳定在6log10CCID50/mL～6.5log10CCID50/mL之间;P4代重组病毒免疫家兔,兔抗血清中麻疹病毒中和抗体效价大于1∶160;Western Blot可检测到免疫兔血清中DENV2NS1的抗体。本文成功构建了以麻疹病毒为载体,表达外源抗原DENV2NS1的重组病毒,为以麻疹病毒为载体的登革疫苗研发奠定基础。

麻疹病毒载体中外源基因插入位置对基因表达及病毒复制的影响

目的研究麻疹病毒(measles virus,MV)沪191株载体中,外源基因插入位置对基因表达及病毒复制的影响。方法将新型冠状病毒S1蛋白表达序列克隆至MV反基因组不同基因间隔区(N基因前、P和M基因之间、H和L基因之间),与分别表达T7聚合酶及N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞,转染后细胞裂解上清感染Vero细胞,以获得重组病毒。通过RT-PCR、免疫荧光法、Western blot和ELISA检测S1蛋白,并对重组病毒的增殖特性进行检测。结果S1克隆至MV N基因前转染未得到重组病毒,克隆至P和M基因之间、H和L基因之间成功获得了重组病毒MV-M-S1、MV-L-S1,并可检测到S1蛋白的表达。MV-M-S1的S1表达量高于MV-L-S1,但病毒滴度低于MV-L-S1。结论将外源基因插入MV基因组中不同位置,对基因表达及病毒复制将产生不同影响,为后续MV载体的改造提供了经验和参考。