实时定量PCR技术检测麻疹病毒的感染与增殖

【目的】建立SYBR-Green RT-qPCR实验体系,通过实时定量PCR技术检测麻疹病毒的感染与增殖情况,为实现实时定量PCR检测病毒滴度奠定基础。【方法】以麻疹病毒N基因氨基端的405 bp片段为靶标,构建质粒标准品用于绘制绝对定量标准曲线。应用该法进行麻疹病毒增殖曲线的绘制和不同感染复数(MOI)接毒的情况下病毒的增殖情况检测。【结果】使用该体系检测出的已知滴度的麻疹病毒毒种参考品的拷贝数与滴度在6 lgCCID50/mL至2 lgCCID50/mL稀释范围内呈线性关系,两者相关系数r=0.991(P<0.01),呈显著性相关。根据检测出的麻疹病毒增殖曲线分析,麻疹病毒进入细胞后,48 h内主要在胞内进行增殖:在24 h内病毒在细胞内处于静默期,检测不到病毒RNA水平的增殖;24 h后病毒大量复制,进入指数增长阶段;于96 h达到顶点后,胞内病毒的RNA总量进入平台期。分泌到胞外的病毒从48 h开始进入指数增长阶段,于144 h病毒量到达顶点,进入平台期。【结论】已初步建立SYBR-Green RT-qPCR验体系并进行病毒增殖情况的监测,对病毒在细胞内增殖及分泌的情况有了初步的了解,为进一步检测减毒活疫苗病毒滴度提供了实验基础。