基于UPLC-Q-ExactiveMS构建麻痹性贝类毒素的特征指纹溯源技术

麻痹性贝类毒素污染是世界共同关注和重点管控的食品安全问题,其溯源一直是产业监管的难点和技术重点。基于指纹溯源技术理论,采用室内模拟3种产毒藻暴露紫贻贝后风险形成过程,开发基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive MS)鉴定麻痹性贝类毒素区域特征的指纹溯源技术。结果表明,采用乙腈/甲醇/丙酮(体积比为1︰1︰1)混合溶液作为提取剂,C8色谱柱联合正离子模式,质荷比(m/z)100~600和Amide色谱柱联合正离子模式,m/z 600~1500作为色谱质谱检测条件下,提取的化合物数量较多且稳定性良好,覆盖了40.4%指纹信息;紫贻贝与产毒藻中的共检出11种毒素成分,且具有高度相关性。N-磺酰胺甲酰基类毒素(如C类)和膝沟藻毒素(GTX类)在暴露期发生了显著的代谢转化;将摄食3种产毒藻后紫贻贝的差异化合物与特征毒素组分进行主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析,共筛选出13种复合指纹物质。构建6种特征物质的Fisher判别模型,交叉验证准确率为88.9%,可实现产毒藻种溯源。该研究建立了基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱UPLC-Q-Exactive MS紫贻贝特征指纹溯源技术,初步实现了从污染麻痹性贝类毒素的贝类到肇事藻种的逆向溯源,可应用于贻贝麻痹性贝类毒素风险溯源研究。

多种产毒藻混合暴露制备麻痹性贝类毒素基体标准物质原料技术

麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins,PSTs)在我国乃至全球引发了严峻的生态和食品安全风险,加强该类毒素的安全监控以确保消费者安全成为全球共识。现有检测技术中,高效液相色谱-串联质谱技术因其高通量、高灵敏度的优势成为国际优先发展技术,但符合国际限量目标的参考物质获取成为发展中国家开展风险监测的核心难题。基于此,本研究通过比较6株产毒藻的单细胞产毒量、藻密度和毒素组分,筛选出的4株产毒藻所产毒素可以覆盖我国海域的主要PSTs,平均藻细胞密度达4.0×10^(6)~4.0×10^(7) cells/L。通过4株产毒藻单一暴露实验发现,贻贝中的PSTs含量能够满足国际限量目标,最高蓄积转化率可达83.1%,且藻与贝中毒素组成基本一致。此外,其中的链状裸甲藻可在贻贝体内代谢转化形成dcSTX,并在5 d达到29.6%的占比。根据上述规律,确定混合暴露实验时链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)、塔玛亚历山大藻(A.tamarense)和微小亚历山大藻(A.minutum)投喂比例低密度组为1∶1∶1∶4,高密度组为1∶1.6∶2.4∶8,其中,高密度组的dcNEO、dcSTX、NEO等3种毒素的占比高于低密度组。4株产毒藻混合暴露获得含NEO、dcSTX、dcNEO、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、C1和C2共12种PSTs,总毒性分别为(535.0±5.6)μg STXeq/kg和(2636.0±12.4)μg STXeq/kg的基体标准物质原料。本研究表明,产毒藻混合暴露可以获得稳定可控的12种PSTs毒素组分,为制备可用于产业监管及行业服务的基体标物提供技术支撑。

水产品中麻痹性贝类毒素研究进展

近年来,有害藻华在中国沿海水域频繁发生。在有害藻华产生的藻毒素中,麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish toxins,PST)分布最广、危害最大,因而受到广泛关注。在被海洋生物摄食后,PST经食物链逐级向上传递、累积,这不仅影响生态环境安全,也威胁人类生命健康。因此,本文重点介绍了PST的定义、来源分布、危害、毒性机制、富集转化和检测方法(生物法、化学法和生物化学法),以及阐述PST的研究趋势、监管建议,旨在为完善PST研究资料、检测及防控措施提供参考。

链状裸甲藻所产麻痹性贝类毒素在翡翠贻贝体内的累积、转化和排出

为研究链状裸甲藻所产麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins,PST)在翡翠贻贝体内的累积、转化和排出规律,设置试验组和对照组,采用链状裸甲藻和中肋骨条藻投喂翡翠贻贝,开展短期累积(12 h)、长期累积(10 d)和排出(28 d)试验。结果表明:翡翠贻贝具有较强的毒素累积能力,内脏团是PST累积的主要部位,PST含量与产毒藻密度呈显著正相关关系。当链状裸甲藻密度为1.0×10^(6)cells/L时,贻贝内脏团PST含量累积2 h已接近食用贝类毒素安全标准,累积8 h超标。当产毒藻密度为5.0×10^(5)cells/L时,贻贝内脏团PST含量累积2 d超标,累积8 d达到峰值(3590.4±545.7)μg/kg。贻贝对PST具有累积快排出慢的特点,内脏团PST含量在排出16 d达标,排出速率先快后慢。内脏团对PST的累积和排出速率显著高于闭壳肌和其他组织,闭壳肌和其他组织则无显著差异。PST进入贻贝体内后发生了代谢转化,贻贝可能将产毒藻中膝沟藻毒素GTX3转化为GTX2,N-磺酰氨甲酰基膝沟藻毒素C2转化为C1,部分C1转化为脱氨甲酰基膝沟藻毒素2(dcGTX2),并将高毒的石房蛤毒素(STX)转化为较低毒的脱氨甲酰基石房蛤毒素(dcSTX)。贻贝对dcSTX有较强的累积能力且排出能力较弱,肝胰腺和肾可能是PST累积的主要部位。该研究可为贝类脱毒与净化、赤潮减灾和水产品质量风险防控提供基础数据和理论依据。

渤海海域唐山贝类养殖区腹泻性和麻痹性贝类毒素的监测与风险评估

为监测渤海海域唐山贝类养殖区贝类毒素的污染情况,防止食用贝类中毒事件发生,于2019年10月—2020年9月间,每月持续在渤海海域唐山贝类养殖区采集四角蛤(Mactra veneriformis)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)、脉红螺(Rapana venosa)、牡蛎(Crassostrea gigas)、青蛤(Cyclina sinensis)、文蛤(Meretrix meretrix)和硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)7种经济贝类样品,采用高效液相色谱–串联质谱(HPLC-MS/MS)法测试了5种腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)和14种麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)。结果显示,在7种经济贝类样品中均未检出DSP。检出的PSP成分包括石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、膝沟藻毒素1(Gonyautoxin 1,GTX 1)、膝沟藻毒素2(Gonyautoxin 2,GTX 2)和脱氨甲酰基膝沟藻毒素3(Ddecarbamoy l gonyautoxin 3,dcGTX 3),其中,GTX 1含量最高且最高值为537.95μg/kg。不同季节贝类毒素蓄积含量有一定差异,PSP主要集中在4月检出。菲律宾蛤仔、牡蛎、文蛤和硬壳蛤中PSP的检出率分别为11.76%、47.06%、5.90%和8.82%,其他贝类均未检出。PSP总量均低于欧盟及中国的食用安全限量标准800μg STXeq/kg。应用风险熵值法和点评估法进行食用安全风险评估,显示风险熵值和暴露风险指数均在安全范围内,结果表明,渤海海域唐山贝类养殖区7种经济贝类不存在食用安全风险。

微小亚历山大藻对近江牡蛎清滤率以及麻痹性贝类毒素(PSP)蓄积的影响

为获知近江牡蛎对有毒微小亚历山大藻的滤食以及蓄积PSP毒素的规律性，本实验采用细胞毒性为（93．42±2．55）×10^3MU／个的微小亚历山大藻投喂近江牡蛎，以无毒扁藻投喂作对照，首先研究了0．5×10^3～3．0×10^3个／mL6个不同浓度的毒藻对近江牡蛎滤食的影响，然后投喂浓度为1．5×10^3个／mL的毒藻，分别研究15h短期蓄积和5d长期蓄积对近江牡蛎体内毒素的影响及规律。结果表明，在0．5×10^3～1．5×10^3个／mL毒藻浓度范围内牡蛎清滤率较高，超过1．5×10^3个／mL时牡蛎清滤率显著下降（P〈0．01），由此确定后期投喂毒藻的浓度“阀值”为1．5×10^3个／mL；短期蓄积实验牡蛎在0～6h内将有毒藻滤食尽，其体内PSP毒素在6—12h间达到最大值[（149．6±10．5）MU／100g]，随后开始下降。长期蓄积实验过程中，牡蛎的清滤率没有发生显著变化（P〉0．01），在蓄积实验的第2天牡蛎体内PSP毒素水平超过国家限量标准（400MU／100g），在5d实验结束时，牡蛎体内PSP毒素水平高达（3069．2±178．2）MU／100g，高于国家限量标准的7．7倍。实验结果作为PSP在近江牡蛎中蓄积及代谢的重要基础数据，为研究PSP的脱除及净化提供思路。

栉孔扇贝对麻痹性贝类毒素的生理响应及转录组分析

本研究将栉孔扇贝(Chlamys farreri)暴露于塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense),通过测定内脏团中毒素的蓄积含量、氧化应激酶活性及其基因转录调控变化,探究栉孔扇贝暴露于麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish toxin,PSTs)的初期应激响应机制。结果显示,PSTs在内脏团中迅速蓄积,实验第6天时毒素含量最高,实验第30天时毒素残留量高达62.4%;PSTs引发栉孔扇贝体内脂质过氧化,过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)显著应激(P<0.05)。透射电镜下观察组织病变,发现空泡化、染色质聚集和核质固缩等结构损伤。通过加权基因共表达网络分析鉴定细胞凋亡和谷胱甘肽代谢解毒通路显著应激上调,映射ALOX5、Af GST-σ11、caspase-8及Bax 4个关键转录因子。综上可知,除抗氧化应激外,栉孔扇贝可激活特征性细胞凋亡和以谷胱甘肽解毒代谢反应抵抗PSTs毒性作用。本研究可为深入探索栉孔扇贝应激与代谢PSTs的特征机制提供科学依据。

水产品中麻痹性贝类毒素(PSP)的快速检测

介绍了美国ABRAXIS麻痹性贝类毒素试剂盒的测定原理和测定方法,应用该试剂盒对广西钦州和防城港海域近江牡蛎样品各20个、北海海域文蛤样品20个,进行麻痹性贝类毒素检测。应用酶联免疫试剂盒检测麻痹性贝类毒素,全部试验过程在2 h内完成,检测限0.02 ng/g,灵敏度为0.015 ng/g。应用ELISA法检测麻痹性贝类毒素,具有简便、快捷、灵敏、成本低廉等特点,非常适于快速检测的实际需求,有望作为理想的筛选分析方法之一,在水产品质量快速检测、养殖区染毒情况调查以及上市贝类质量监控方面发挥重要作用。

麻痹性贝毒毒素(PSP)及其产毒藻对海洋鱼类危害的研究

麻痹性贝毒毒素(PSP)是海洋赤潮藻毒素中分布最广、危害最严重的一种藻毒素,是甲藻等有毒藻产生的一类四氢嘌呤毒素的总称。近年来的研究表明,PSP对鱼类有强烈的致死作用。海洋鱼类除了受到PSP及其产毒藻的急性毒性影响而死亡外,在受到非致死性的毒性作用时,鱼的其它生理状态也会发生一定的变化:如酶活性增加或降低、细胞坏死脱落以及鱼的行为改变等。

超高效液相色谱-串联质谱法测定血浆与尿液中14种麻痹性贝类毒素

人体生物基质中麻痹性贝类毒素的检测对其引起的食物中毒诊断和救治具有重要意义。研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定血浆、尿液中14种麻痹性贝类毒素的分析方法。实验比较了不同固相萃取柱的影响,优化了前处理条件和色谱条件,血浆样品采用0.2 mL水、0.4 mL甲醇、0.6 mL乙腈提取后直接上机测定,尿液样品采用0.2 mL水、0.4 mL甲醇、0.6 mL乙腈提取,聚酰胺(PA)固相萃取柱净化后上机测定。采用Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm)对14种贝类毒素进行分离,流动相为含0.1%(v/v)甲酸的5 mmoL/L甲酸铵缓冲溶液和0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液,流速为0.50 mL/min。在电喷雾模式(ESI)下进行正负离子扫描,采用多反应监测(MRM)模式检测,外标法定量。结果表明,对于血浆和尿液样品,14种贝类毒素分别在0.24~84.06 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数均大于0.995。尿液检测的定量限为4.80~34.40 ng/mL,血浆检测的定量限为1.68~12.04 ng/mL。尿液和血浆样品在1、2和10倍定量限加标水平下平均回收率为70.4%~123.4%,日内精密度为2.3%~19.1%,日间精密度为4.0%~16.2%。应用建立的方法对腹腔注射14种贝类毒素小鼠血浆和尿液进行测定,20份血浆样本中检出含量分别为19.40~55.60μg/L和8.75~13.86μg/L。该方法操作简便,样品取样量少,方法灵敏度高,适用于血浆和尿液中麻痹性贝类毒素的快速检测。

麻痹性贝类毒素研究进展

麻痹性贝类中毒在全球贝类中毒中最常见,分布最广、危害最大、死亡率最高,对人民生命健康造成极大威胁。麻痹性贝类毒素毒性很大,人口服不到1 mg便可致死,对神经和肌肉具有麻痹作用,影响生物神经系统和心血管系统。麻痹性贝类毒素衍生物众多且结构相似,可以相互转化,检测难度大。本文综述了麻痹性贝类毒素的性质、作用机制、中毒症状和代谢途径,并对固相萃取法、分散固相萃取法、免疫亲和层析法等前处理方法以及小鼠生物法、免疫分析法、液相色谱–荧光检测法、液相色谱–质谱联用法等相关检测方法进行了总结,以期为麻痹性贝类毒素的研究,有关检测方法的开发与完善,法庭科学毒物检验以及相关标准的制定提供参考。

麻痹性贝类毒素分析检测净化处理方法研究进展

麻痹性贝类毒素是一类毒性很强且具有高发性的海洋生物毒素,目前,主要的检测方法有小鼠生物法、酶联免疫法、液相色谱法以及液相色谱-质谱联用法等。由于毒素含量通常较低,且生物体基质干扰很大,选择合适有效的净化处理方法已成为分析检测的关键环节。本文综述了麻痹性贝类毒素分析检测净化处理方法及研究进展,以期为相关从业者提供参考。

牡蛎基体麻痹性贝类毒素GTX1-4标准样品的研制

贝类食品安全是重大公共卫生问题,然而贝类毒素标准品和标准样品均很难获得。将天然产生麻痹性贝类毒素膝沟藻毒素1-4(Gonyaulax toxin 1-4,GTX1-4)的链状裸甲藻培养液与牡蛎肉均质混匀,冷冻干燥脱水后,反复过筛分处理制备成松散状细粉。采用液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)测定牡蛎基体中GTX1-4含量,并比较不同制备工艺对特性值分散度的影响。样品分装成500瓶,进行均匀性、稳定性、赋值及不确定度评估。结果表明,标准样品均匀性、长期稳定性和模拟运输条件下的短期稳定性良好,特性参考值可靠,达到标准样品的技术要求,为有效开展实验室质量控制和能力评价活动,保护消费者安全具有重要意义。

扇贝中麻痹性毒素的提取与分离纯化

为了获得麻痹性毒素标准品,以毒化扇贝为试验材料,对扇贝中的麻痹性毒素(PSP毒素)进行了提取和分离纯化。以酸性80%乙醇溶液反复提取麻痹性毒素,得到了总毒性为6170MU的毒素粗提液。毒素粗提液经过超滤、Bio-GelP-2凝胶柱层析和Bio-Rex70离子交换柱层析等二次层析柱分离纯化后得到以膝沟藻毒素群(GTXs)为主的纯化PSP毒素。HPLC分析结果显示,扇贝中主要含有膝沟藻毒素GTX3,GTX1、GTX2、GTX3、和GTX4的组成比例约为2∶4∶14∶1(以HPLC上的峰面积比例计)。纯化后的毒素可以作为标准物质用于GTX1-4的HPLC分析。

广东沿海麻痹性贝类毒素的研究

于1990－1992年间在广东沿海采集24种贝类，用麻痹性贝类毒素小白鼠生物测定法对所采样品进行毒素分析研究。结果表明，所检测的大部分生物体均不同程度的积累了麻痹性毒素；大亚湾和大鹏湾2种贝体内存在着12或13种麻痹性毒素的成分；贝体中麻痹性毒素存在着一定的季节差异。还对贝体中的毒素和有毒藻类的出现进行了简单的讨论。

大亚湾和大鹏湾麻痹性贝类毒素动态分析

于 1 997～ 1 999年在大亚湾和大鹏湾的主要贝类养殖区设立了四个采样点 ,以华贵栉孔扇贝和翡翠贻贝为对象逐月采样 ,用美国分析化学家协会推荐的生物测定法进行麻痹性贝类毒素测定。结果显示 ,1 999年 1月～ 1 999年 6月大亚湾东山海域的扇贝消化腺毒素含量为 1 2 63～ 1 0 5Mu/g ,剔除消化腺后的其他软组织毒素含量为 1 3 4至低于 1 7Mu/g ,消化腺和其他软组织毒素含量的加权平均值为 7 7～ 1 1 7Mu/g ,高于联合国粮农组织制定的贝类安全食用标准的限定值 4Mu/g ,尤其是 1月份 ,超过限定值近 30倍。同期该样点的贻贝消化腺毒素含量为 0～ 567Mu/g ,剔除消化腺后的其他软组织毒素含量为 0～ 1 4 2Mu/g ,消化腺和其他软组织毒素含量的加权平均值为 0～ 72 8Mu/g ,仅在 1月份贻贝毒素含量超标。总体上贝毒含量表现为由冬春季高峰期逐月波动下降的趋势。大亚湾澳头海域的两种贝类毒素含量都不高 ,扇贝长期含有较低的毒素 ,贻贝在大部分时间内不含毒素 ,仅在 1 998年 5月间 ,出现一低于 3 5Mu/g的高峰期。大鹏湾南澳海域的两种贝类毒素含量不高 ,贻贝毒素含量均低于生物测定法极限值 ,而扇贝消化腺毒素含量仅 1 998～ 1 999年冬季略有超标。本文还就麻痹性贝毒的分布与贝类种类、时空间的关系进行?

中国东海和南海有害赤潮高发区麻痹性贝毒素研究

用小白鼠生物检测法和高效液相色谱法对采自浙江舟山和广东深圳海域贝类的麻痹性贝毒素进行了调查和分析 .结果表明 ,舟山海域近岸的贝类毒素检出率为 14 % ,染毒的贝类毒素含量不高 ,低于小白鼠生物检测法的测定范围 ;深圳近岸贝类毒素检出率为 30 %以上 ,华贵栉孔扇贝是主要的染毒贝类 ,有1个样品毒素含量达 5 .1Mu·g-1,超出安全食用标准 .从深圳大亚湾华贵栉孔扇贝检测出 10种麻痹性贝毒素成分 ,消化腺的主要毒素成分为GTX1+ 2 和GTX5,C1+ 2 和GTX2 + 3 ,而剔除消化腺后其余贝组织的主要成分为neoSTX和GTX5.贝毒素主要积累在扇贝的消化腺内 ,消化腺含有的毒素是贝肉组织的 8倍 .

广东大亚湾和大鹏湾麻痹性贝类毒素研究

于１９９７－１９９９年在广东大亚湾和大鹏湾的主要贝类养殖区设立了４个采样点，以华贵栉孔扇贝和翡翠贻贝为对象逐月采样，以美国分析化学家协会（ＡＯＡＣ）推荐的小白鼠法测定其麻痹性贝类毒素（ＰＳＰ）含量．１９９９年１－６月大亚湾东山海域的扇贝贝毒含量高于联合国粮农组织（ＦＡＯ）制定的贝类安全食用标准的限定值，尤其是１月份，超过限定值近３０倍．贻贝仅１月份超标．总体上贝毒含量表现为由冬春季高峰期逐月波动下降的趋势．大亚湾澳头和大鹏湾南澳的两种贝类毒素含量都不高，扇贝长期含有较低的毒素，贻贝在大部分时间内不含毒素．

枝角类为媒介的麻痹性贝类毒素传递与代谢研究

为了弄清麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)在海洋生态系统中的产生、转化和归宿,本文以海洋枝角类为媒介,研究了麻痹性贝类毒素在海洋食物链中的传递与代谢过程。结果表明,PSP毒素可以沿甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)→枝角类蒙古裸腹溞(Moina mongolica)→红鳍东方鲀(Fugu rubripes)鱼苗进行传递和代谢。整个实验过程中,塔玛亚历山大藻、蒙古裸腹溞、红鳍东方鲀均检测到C1+2,鱼苗体内还发现似新生成的neoSTX。毒素传递过程中,C1+2中低毒性的α型毒素C1比例增大;毒素在鱼苗体内净化时,各PSP成分和总毒素含量普遍随净化时间的延长而减少。该结果为解释麻痹性贝类毒素为何在海洋各营养级生物体中广泛存在提供了直接的证据,也为我国开展麻痹性贝类毒素的监测和管理提供了新的理论依据。