抗麻风杆菌酚糖脂1末端三糖的单克隆抗体的制备

将麻风杆菌特异性抗原酚糖脂Ⅰ(phenolic glycolipid I,PGL-I)包被在明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minisota)表面,制成免疫原、脾脏内免疫BALB/c鼠,取免疫鼠脾脏制成脾细胞悬液,与Sp2/0细胞按常法融合,选择性培养。凡有克隆生长的,对其上清,用人工合成、含PGL-I末端三糖的人工半合成抗原——NT-O-BSA作ELISA进行筛选。从中选择了一株对PGL-I末端三糖表位特异的单克隆抗体——E_(10)F_1进行了初步鉴定。E_(10)F_1的Ig亚类为IgG3,与大多数抗糖抗体的Ig亚类一致。经ELISA及斑点免疫吸附试验鉴定,E_(10)F_1仅与PGL-I包被的明尼苏达沙门氏菌出现阳性反应,不与明尼苏达沙门氏菌、BSA、BCG、耻垢分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌发生反应。证明单克隆抗体E_(10)F_1所识别的抗原表位为PGL-I分子末端三糖,也是麻风杆菌的特异性抗原表位。文中对制备抗糖的单克隆抗体的实验设计进行了讨论。

人麻风杆菌在裸鼠中的增殖

本文报告了麻风杆菌在裸鼠(NIH/nu/nu)体内的大量增殖。麻风杆菌经足垫皮下接种(1.0×10~4)后,菌在裸鼠足垫中出现持续增高。至感染后21个月,足垫乎均菌量大于1.08×10~9,菌数增长了108000倍,每克组织含菌量大于5.4×10^(10);而平行接种的CFW系免疫正常小鼠的足垫平均菌量为3.68×10~?,表现为局限性增殖.麻风菌在裸鼠体内的生长对数期明显延长.对裸鼠体内增殖的抗酸杆菌(AFB)进行鉴定的结果表明;①不能在可培养分枝杆菌的培养基上生长;②吡啶提取试验失去抗酸性;③在鼠足垫试验中呈典型的麻风杆菌生长曲线,并对抗麻风药物如氨苯砜,利福平完全敏感。这些实验结果证明了在裸鼠体内增殖的AFB是人麻风杆菌. 从受感染的裸鼠组织病理学检查所见.被感染了的麻风杆菌也能播散到其他脏器和非接种部位;又从接种麻风菌的足垫部位的组织切片中见许多大小菌团;呈现瘤型麻风病变. 上述结果证明了裸鼠实验麻风模型的建立是成功的.对今后开展麻风病的防治研究工作更有促进作用.

麻风病流行区水、土壤中麻风杆菌的检测初步报告

目的：检测云南省丘北县水、土壤中是否存在麻风杆菌，探究水、土壤是否充当麻风杆菌病原库。方法：从麻风病不同流行程度的村庄采集水、土壤，从中分离出微生物、提取DNA；Nested—PCR扩增后直接测序，用基本局域线性搜索工具（BLAST）与NCBIGenBank中的标准序列进行比较，以确认PCR产物是否为麻风杆菌。结果：从36个采样点采集的59份水样中，有29份PCR阳性，其中18份标本测序后能确认为麻风杆菌。从7个采样点采集的11份土样中有7份PCR阳性，其中3份标本测序后能确认为麻风杆菌。结论：麻风病流行村庄水、土壤中存在的麻风杆菌可能是麻风病的传染源。

单管巢式实时PCR检测麻风杆菌方法的建立及初步应用

目的：明确单管巢式实时 PCR 检测麻风杆菌的特异性、灵敏性和重复性。方法：以麻风杆菌 hsp18基因为靶基因设计引物和探针，建立单管巢式实时 PCR 方法检测麻风杆菌并与抗酸染色及普通 PCR 进行特异性和灵敏性的比较。结果：单管巢式实时 PCR 检测下限为2.1 fg 质粒 DNA，普通PCR 为21 fg 质粒 DNA，敏感性高10倍；与8种非麻风杆菌无交叉反应；批内相对标准偏差（RSD）为0.24％~1.08％，批间 RSD 为0.09％~2.8％。对比检测54例麻风疑似标本中，抗酸染色、普通 PCR 和单管巢式实时 PCR 的敏感性分别为81.3％（26/32）、87.5％（28/32）和96.9％（31/32）。结论：单管巢式实时 PCR 特异性强、敏感性高且重复性好。

麻风杆菌重组α抗原的应用研究:α2-ELISA的建立

目的：以重组麻风杆菌α２融合蛋白为抗原，建立酶联免疫吸附试验，即 α２－ ＥＬＩＳＡ。方法：用麻风病人和健康正常人的血清评价了α２－ＥＬＩＳＡ中有关试剂及最适浓度，其敏感性与ＰＧＬ－１－ＥＬＩＳＡ进行了比较。结果：（１）挥发性缓冲液醋酸铵碳酸盐（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ）为α２抗原最佳包被液；（２）重组α２融合蛋白的最适包被浓度为５ μｇ／ｍｌ；（３）显色剂 ＯＰＤ的敏感性大于ＴＭＢ；（４）麻风病人血清中的抗体滴度分别为ｌｇＧ＞ｌｇＭ＞ｌｇＡ；结论：确定了α２－ＥＬＩＳＡ方法的最适实验条件，且该方法的敏感性与ＰＧＬ－１－ＥＬＩＳＡ相比无统计学差异，可望成为一种新的麻风血清学诊断和流行病学研究的方法。

不同方法检测水中麻风杆菌的比较

目的: 比较不同方法检测水中麻风杆菌DNA分子的敏感性和特异性。方法:采用不同方法提取不同水样中的DNA,用巢式PCR扩增麻风杆菌特异性重复序列。结果:对浑浊水样,DNA StoolKit提取DNA的效果优于粗提法;对于澄清水,DNA Mini Kit提取DNA的效果与粗提法相同。提高退火温度、减少循环数,PCR检出水平不变,非特异性扩增减少。结论:对不同外观的水样,采用不同方法提取DNA与优化PCR反应条件以减少非特异性扩增很有必要。

麻风流行区饮用水中麻风杆菌的分子生物学检测

目的:检测麻风病流行区饮用水中麻风杆菌DNA,以探讨其对麻风流行区麻风持续流行的影响。方法:分别从云南丘北县有、无患者村和北京非流行区乡村采集70份水样,提取DNA、PCR扩增后测序检测样品中麻风杆菌DNA。结果:流行区36.7%(22/60)的水样含麻风杆菌DNA,而非流行区水样中未检出麻风杆菌。流行区有患者的村庄中,患者和健康者家庭内饮水中麻风杆菌的检出率有统计学差异。结论:麻风流行区患者家庭饮用水中麻风菌的存在可能与持续性流行有关,但须进一步研究。

国产盐酸二甲胺四环素对裸鼠体内麻风杆菌的影响

本研究系用麻风裸鼠实验模型，采用动力法投药１０５天，观察了０．０２％二甲胺四环素（美满霉素，ＭＩＮＯ）和０．０４％ＭＩＮＯ的抗麻风杆菌活性，并同０．０２％进口ＭＩＮＯ和已知抗麻风药物０．０２％利福平（ＲＦＰ）进行了平行比较。实验结果表明，国产ＭＩＮＯ儿进口ＭＩＮＯ的实验疗效基本一致，而且，随着药物剂量的提高，抑制麻风杆蓖作用增强。在停药早期，以０．０４％ＭＩＮＯ组疗效最佳，显示有部分杀菌活性，但是，随着停药时间的延长，ＡＦＰ比ＭＩＮＯ的抗菌活性稳定而持久。

麻风杆菌的分子生物学检测研究进展

麻风杆菌作为麻风的病原体,至今仍不能体外培养。而麻风虽经联合治疗患病率渐下降,但新发病例数并未明显减少。近期发展起来的分子生物学则应用于麻风杆菌的菌株鉴别、活力测定,麻风的传播、诊断、耐药监测、易感基因检测等多个方面,试图从分子水平增加对麻风杆菌及麻风病的认识,以便从发病、流行等方面进一步控制及消灭麻风。

利福平对麻风杆菌抑菌的临界浓度的实验研究

用鼠足垫实验将４例新发麻风病人菌液感染小鼠，采用管饲法给以３种不同剂量利福平（ＲＭＰ），测定麻风菌对ＲＭＰ的敏感性及ＲＭＰ的最小有效剂量（ＭＥＤ）和最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。结果表明，４株麻风菌的ＭＥＤ均≤５ｍｇ／ｋｇ，其中３株为２．５ｍｇ／ｋｇ，对其中３株所感染的小鼠血清中ＲＭＰ浓度进行测定，结果显示，不同剂量的给药组小鼠血清中浓度有显著差异，ＲＭＰ对不同菌株的ＭＩＣ也有差异，分别为１．５μｇ／ｍｌ，０．８μｇ／ｍｌ，０．５μｇ／ｍｌ。

麻风杆菌α2抗原基因的克隆及表达研究

目的用现代分子生物学技术即基因工程手段制备麻风杆菌抗原。方法用原位斑点杂交法筛选阳性克隆，并对其中一株约３０００ｂｐ的ＤＮＡ片段进行酶谱和ＤＮＡ序列分析。结果从本实验组制备的麻风杆菌基因文库中筛选出２株含α２抗原的基因片段，并建立了α２抗原基因在大肠杆菌中的表达体系，在ＸＬＩ－Ｂｌｕｅ菌株中大量表达出易于提纯的α２重组融合蛋白抗原，经麦芽糖亲和色谱柱提纯后，每２００ｍｌ转化宿主菌培养液可获得１０ｍｇ重组融合蛋白。结论α２重组融合蛋白抗原的制备对于探讨麻风病的发病机制、建立麻风病和其它抗酸杆菌疾病（如结核病等）的高度特异性血清学诊断方法都有意义。

麻风杆菌去乙酰酚糖脂血清学活性的初步研究

麻风病人血清对D-PG有很高的IgM抗体活性。受试多菌型病人呈现100％阳性反应,少菌型病人也显示75～83％的阳性反应。IgG和IgA类抗体在受试的多菌型病人也均呈现100％的阳性反应,但在少菌型病人,其MOD大多低于正常人;用鸡卵清可代替小牛血清蛋白在D-PG-ELISA中做封闭剂;国产板可代替进口板进行D-PG-ELISA。文中还讨论了影响D-PG-ELISA的某些因素。

耐利福平麻风杆菌的研究进展

自1976年首次报告麻风杆菌对利福平耐药以来,有关耐利福平麻风病例的报告也日益增多,引起了麻风工作者的高度重视。随着对利福平耐药基因基础的深入研究,发现基因突变起着决定性的作用,并在此基础上发展了一系列快速的分子生物学诊断方法,为利福平耐药菌株的快速诊断打下了基础。

麻风杆菌生化代谢研究的进展

麻风杆菌(ML)虽是1873年就被发现的第一种人类致病的病原菌,但直至今天仍是微生物学家之谜。不但体外培养试验收效甚微,而且与其他微生物相比分子生物学方面的进展也非常有限。回顾二十年来ML 生化代谢的研究,尽管进展缓慢,但确有肯定的进展,而这些进展对当今麻风防治研究有较大的理论和实践意义,现将有关方面的资料作一整理,以供参考。一、ML 代谢研究的主要障碍和研究方法(一)ML 代谢研究的主要障碍:由于ML 体外培养尚未获得成功。

甲氟哌酸和氟嗪酸在抗麻风杆菌方面的研究进展

目前主要以氨苯砜(DDS)、利福平(RFP)和氯苯吩嗪(B663)或硫酰胺类(TH)多种药物治疗麻风,其中只有RFP具有强效的杀菌作用。由于麻风杆菌对上述所有药物均产生了耐药菌株和现有药物均有一定的毒副作用,故急待开发新的具有杀菌作用的抗麻风药物。在这方面研究最多的是氟喹诺酮类药物中的甲氟哌酸(Pefloxa—

小鼠体内抗麻风杆菌PGL-1抗体水平消长的观察

用间接ELISA测定用BCG、、不完全佐剂、^(60)Co照射麻风杆菌(IML)和犰狳麻风菌素提纯麻风杆菌(LML)免疫BALB/c小鼠后的抗麻风杆菌PGL-I循环抗体水平。所用抗原为耻垢分枝杆菌(Ms)和PGL-1。结果表明:在不完全佐剂免疫组没有检到任何种抗体;在BCG免疫组没检到抗PGL-1抗体,但检到IgG和IgM类交叉反应抗体;在IML和LML免疫组均检到IgG和IgM类交叉反应抗体和特异的抗PGL-1抗体。上述各类抗体水平在免疫后一个月逐渐升高,并持续2～3个月,尔后下降。IgM类抗体占优势,尤以抗PGL-1抗体为显。没发现IgG和IgM类抗体出现时序上的差别。

麻风杆菌多途径接种裸鼠的研究

用麻风杆菌经静脉内、后足垫和耳皮下多途径接种裸鼠。在裸鼠接种菌后307、334、497、和625天分别剖杀1—2只裸鼠,取接种足垫和耳部皮损、胭窝淋巴结、鼻、坐骨神经、尾部皮肤损害、舌、肝、脾、肺、肾和心脏称重后制成匀浆,作菌计数。同时各取部分组织作组织病理学检查。实验结果表明,裸鼠经过多途径接种麻风杆菌后,其菌量增殖明显高于以往报告的单途径接种方法所取得的结果。尤其在接种部位的后足垫及耳部,最高菌量分别达到2.85×10~11/g(497天)和6.28×10~12/g(625天)。虽然麻风杆菌的世代时间近似,但对数生长期时间明显延长。结果也表明,多途径接种方法能使裸鼠发生更严重的病变和系统性播散。组织病理学检查表明,经抗酸染色的足垫组织切片中,在横纹肌、血管壁内皮细胞和血管中均可见到大量抗酸杆菌(AFB)及菌团,皮神经束膜内外和雪旺氏细胞中也找到了许多AFB。最终在整个足垫组织中充满了AFB。HE染色呈瘤型麻风进行性病变,肉芽肿浸润由含大量AFB的泡沫细胞和巨噬细胞构成,直至泡沫细胞组成的麻风瘤病变完全代替了正常结构。各个部位相比较,低体温部位如足垫、耳、鼻及尾部仍然是麻风菌繁殖的优势部位。横纹肌及外周神经是麻风菌好侵犯之处,也显示了麻风菌在裸鼠体内感染的特点。

麻风杆菌分子生物学研究的进展

本文系统复习了用分子生物学方法在研究麻风杆菌组成、生长、代谢、耐药、检测及其有关抗原成分的分析和DNA重组后表达物质的生物活性等方面的最新进展,同时对存在的问题及未来的远景作了分析和展望。

荧光PCR法对麻风现症患者与治愈者鼻分泌物麻风杆菌检测结果分析

目的探讨荧光定量PCR检测鼻分泌物麻风杆菌DNA的应用,以及了解麻风联合化疗的效果和复发情况。方法对5例麻风现症患者不同时期和32例经联合化疗治愈者共41份鼻分泌物样本,进行荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA,同时取皮肤组织液样本同样检测作对照。结果麻风现症患者不同时期的9份鼻分泌物荧光定量PCR检测阳性7份,皮肤组织液检测阳性8份;而32例治愈者的鼻分泌物样本和皮肤组织液样本麻风杆菌DNA均为阴性,两组阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论荧光PCR检测鼻分泌物麻风杆菌DNA是一种可行的方法,联合化疗,对麻风病效果好,且未发现复发。