RT-PCR检测16S rRNA基因片段对麻风菌活性的评价

目的:探讨麻风病患者皮损组织中麻风菌16S rRNA基因片段判断麻风菌活性的应用价值。方法:根据BI值和联合化疗(MDT)的疗期对27例麻风患者分组,以RT-PCR法检测皮损组织中麻风菌16S rRNA的特异性片段。结果:(1)无论BI高低,未经治疗的患者16S rRNA均为阳性。(2)MDT治疗、BI≥3～6者的11例患者中:有9例16SrRNA为阳性,MDT疗期小于和大于6个月的两组中均各有1例患者16S rRNA阴性。(3)MDT治疗、BI≤2的6例患者:有1例MDT小于6个月病人其16S rRNA阳性,其余5例患者16SrRNA均为阴性。结论:随MDT治疗的进行,麻风菌16S rRNA阳性患者比例减少;诊断时BI值越低的患者中,经治疗后皮损中麻风菌16S rRNA阴转的比例增大,提示麻风菌16S rRNA与患者皮损中麻风菌活性具有相关性。

32株麻风菌rpoT基因和SNP基因分型

目的:了解中国麻风菌株rpoT和SNP基因型特征及地理分布。方法:从32例中国麻风病患者皮损组织中提取DNA。rpoT基因分型采用PCR-直接测序;SNP分型采用PCR-直接测序和PCR-限制性片段长度多态性分析。结果:32份中国菌株的SNP均为3型。32份菌株中,来自我国东南部和藏族地区的12份菌株rpoT基因为4个拷贝;来自云贵川的20份菌株rpoT基因为3个拷贝。结论:32份菌株均为SNP3型,但我国不同地区rpoT基因型不一致,有待进一步研究。

云贵川三省麻风菌株基因分型的比较研究

目的:了解云南、四川、贵州三省麻风菌株基因型的地理分布。方法:从云南省丘北县、四川省凉山州、贵州省兴义市分别采集59、21、31例麻风患者皮损活检,提取麻风菌DNA,对6-7、AC9、GTA9 3个数目可变的串联重复(variable-number tandem repeat,VNTR)位点的PCR产物测序,确定各位点重复序列数进行分型。结果:三省在6-7位点上有5种基因型,云南以7个拷贝的基因型为主,其它两地区的菌株在该位点的等位基因型为7、8、9,其分布无显著性差异。AC9位点上有4种基因型,三省均以8个拷贝的基因型为主。GTA9位点有非常明显的多样性。云南GTA9为9个拷贝的菌株占总菌株数的18.18%。结论:本研究结果提示麻风菌的基因型与地理分布有关。但需要以更多的位点,了解以VNTR为主的基因分型能否应用于麻风病的传染源和传播链的流行病学研究。

建立巢式PCR和异源双链法检测石蜡标本麻风菌DDS耐药株

目的:为了能检出石蜡包埋组织中麻风菌氨苯砜(DDS)的耐药基因folP1,有必要建立敏感、特异的巢式PCR,为开展回顾性麻风菌DDS耐药流行病学研究服务。方法:从石蜡组织中提取麻风菌DNA,建立巢式PCR,优化PCR条件,扩增DDS耐药基因片段。用异源双链法筛选突变菌株,并经直接测序进一步证实。结果:巢式PCR将PCR检测folP1的敏感性,从6.5%(3/46)提高到76.7%(33/43);优化后的巢式PCR,最终使敏感性更进一步提高至90.7%(39/43)。8株folP1突变菌、两种突变型被发现。结论:巢式PCR是一项快速、简便、可行的方法。通过优化多项PCR条件,提高了石蜡包埋组织中folP1检测的敏感性和特异性。异源双链法可用于筛选DDS耐药突变菌株。

云南省丘北县麻风菌株基因分型研究

目的:验证云南省丘北县麻风菌株与流行病学间的关联性。方法:对2003-2007年发现的106例新麻风患者菌株进行了6个VNTR位点分型,以系统发育树分析与流行病学的关联性。结果:丘北菌株依据(GTA)9等位基因型可分为两大菌群。第一枝由(GTA)9位点从9到13个重复数组成的A、B和C聚集株,主要分布在该县北部和西北部;第二枝由(GTA)9重复数高达20以上的D、E菌株组成,主要分布在中部和东南部。A至F聚集株内,至少有两个或以上有多个患者的家庭。第一菌群内患者间有明显的流行病学关联,但第二菌群内患者则缺乏关联性。结论:(GTA)9等位基因高度多态菌群来源与异质性的原因不清楚。以家庭和邻居关联的麻风病传播在丘北县很常见,有多个患者的家庭,感染菌株可能来自相同的传播链。

实时荧光定量PCR检测石蜡标本中麻风菌DNA

目的:评价实时定量荧光PCR(Real-time PCR)法检测石蜡标本中麻风菌DNA的应用价值。方法:根据基因库(GenBank)发表的M.leprae的全基因组序列,以一段重复序列(repetitive element,RLEP)为扩增靶序列,合成引物和探针,构建质粒pGEMT-101作为标准品,用Real-time PCR对石蜡标本进行麻风菌DNA检测,并评价其敏感性。结果:对52例麻风患者的石蜡包埋组织标本麻风菌进行了检测,不同型别麻风(LL:8;BL:10;BT:28;TT:6)的石蜡标本检测阳性率分别为100%(8/8)、80%(8/10)、78.57%(22/28)、50%(3/6)。结论:Real-time PCR方法可在石蜡标本中快速灵敏的检测到麻风菌DNA。

几种检测麻风菌的基因扩增试验的比较研究

对检测麻风菌用的几种PCR方法进行了比较研究。这些PCR以编码麻风菌65KD、36KD、18KD、groEL和16S rRNA的基因为基础。比较用的指标是敏感性、特异性、简易快速和节省试剂,结果显示以编码麻风菌65KD抗原的基因为基础的PCR(此法原为Woods报告,后经我们优化改良)为最实用,其检测下限为10～100条麻风菌,与其它已知的分枝菌无交叉反应,用单对引物,仅需30个循环,以2.5～3个小时就能完成实验,且用料仅为其它常用反应体系的1/2,敏感性高、特异性强,简单、快速、价廉,故适于推广应用。

麻风病的药物治疗和麻风菌耐药的研究进展

自从20世纪40年代开始用化学药物治疗麻风病以来,各种药物作用和耐药菌的发生、监测等研究一直是人们非常关注的焦点。随着分子生物学研究的发展,在麻风菌耐药的分子机理的研究上又有新的突破,为采用更简便的分子生物学技术检测耐药菌奠定了基础。本文就麻风病的药物治疗和麻风菌耐药的发生和研究进展做一简要综述。

酚糖酯-免疫球蛋白M和鼻分泌物中麻风菌PCR检测在麻风流行病学中的应用

目的通过对流行乡村(同烘和南丘)麻风病患者、家内接触者及普通人群麻风菌感染的检测,评估实验流行病学对预测麻风病传播的意义。方法采用酚糖酯-酶联免疫吸附试验(PGL-ELISA)和检测鼻携带麻风菌的PCR方法,开展流行病学调查。结果(1)麻风病家内接触者的酚糖酯-免疫球蛋白M(PGL-IgM)阳性率和PCR检测的麻风菌鼻携带率分别为30.4%和23.1%;但PGL抗体阳性率在家内接触者和普通村民之间却无显著性差异。(2)两村普通村民的PGL-IgM阳性率,在统计学上无显著差异。然而,在<20岁的年龄组中,同烘村的PGL-IgM阳性率却显著高于南丘村。无论同烘或南丘村,PGL-IgM阳性率高峰均在<20岁的年龄组。随年龄的增加,阳性率逐渐下降。此外,女性的PGL-IgM阳性率高于男性。结论两村的新发现病人主要为年轻人,这与两村PGL-IgM阳性高峰位于<20岁年龄组相关。在<20岁的年龄组中,同烘村的PGL-IgM阳性率显著高于南丘村,除与同烘村患病率和发现率均高于南丘村相关,也与消除麻风病运动(LEC)后,同烘村仍有新病人出现有关。这一现象似乎支持麻风患病率与PGL-IgM阳性率相关。为评价麻风病的传播是否得到控制,以PGL的血清学仍是一种有用的方法。

高效麻风菌基因组DNA库的建立及评价

以构建的噬菌体λｇｔｌｌ为载体，插入平均长度为４ｋｂ的麻风菌ＤＮＡ片段，建立了ＭＬ基因组ＤＮＡ库。重组效率检测表明，阳性重组噬菌体颗粒浓度为６×１０＾４ｐｆｕｍｌ（噬斑形成单位／ｍｌ），且扩增为２．６×１０＾８ｐｆｕ／ｍｌ建立了高重效率和高浓度的ＭＬ ＤＮＡ重组噬菌体颗粒悬液，成为ＭＬ基因组ＤＮＡ库的永久来源。

麻风菌抗原诱导IL-12产生的体外研究

目的:检测麻风菌不同抗原脂蛋白诱导单个核细胞(PBMC)IL-12p40分泌水平。方法:以麻风菌不同抗原刺激体外培养的少菌型(PB)、多菌型(MB)麻风患者及健康接触者PBMC,加入或不加外源性IFN-γ共培养,ELISA检测培养上清的IL-12p40分泌水平。结果:(1)麻风菌胞浆抗原(MLSA)和麻风菌33KDa脂蛋白可诱导健康接触者、PB患者PBMC分泌IL-12p40;(2)外源性IFN-γ可上调健康接触者和PB患者PBMC分泌IL-12p40水平。结论:麻风菌33KDa脂蛋白是PB患者IL-12p40的有效诱导剂,外源性IFN-γ可上调IL-12p40分泌,为麻风病免疫治疗的建立提供了依据。

全球麻风菌耐药监测进展

目前WHO已在全球9个国家建立麻风菌耐药监测点,对联合化疗后复发的多菌型麻风病人检测抗麻风耐药菌株。目前氨苯砜、利福平和氧氟沙星的耐药菌株在全世界均已被发现,尚未发现克拉霉素、氯法齐明耐药突变位点,米诺环素尚未确定耐药菌株。有必要寻找不同药物的耐药菌株及突变位点,同时建立简便可行的耐药检测方法及完善的耐药监测机制。

麻风菌接种树鼩的研究

树鼩系一种低等的灵长类动物,在种系发生上与人类近缘。用取自多菌型麻风病人的麻风菌经足垫5.0×10~4/足垫)及静脉(1.0×10~7)分别接种树鼩,同时用 CEW 系小鼠的足垫接种作对照。结果发现接种12个月后,AFB 均能在体温低的足垫内增殖,此时 AFB 住 CFW 系小鼠足垫中的增殖已由上升转为明显下降,而树鼩足垫中的菌量则明显上升,到接种后18个月菌量已高达2.44×10~9/克组织,足垫还呈轻度肿胀,病理险查见大片以巨噬细胞为主的肉芽肿,并有趋于泡沫化的巨噬细胞,含有大量的 AFB 及菌团。皮神经也受侵犯;在多种脏器组织中也能找到 AFB。对树鼩体内增殖的这种 AFB 正在鉴定中。

麻风单克隆抗体的研究Ⅱ:产生抗麻风菌超声物单克隆抗体的初步报告

用SP_2/O骨髓瘤细胞与MLSS做抗原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合后获得3株抗MISS蛋白的McAb,其代表株ⅡE_(10)H_8E_7经59次传代证明仍能稳定地分泌McAb。在McAb亚类检测中发现,上清中除含有抗MLSS蛋白的McAb外,尚含有抗ML整菌及ND—O—BSA的McAb。作者对这种现象的原因和意义,以及克隆化方案和诱生腹水的诸多因素做了详细讨论。

酶联增敏试验——一种低麻风菌抗体检测法

在间接ELISA中使用了增敏剂(SR)。用增敏的(SM)与未增敏的(OM)ELISA比较,结果表明:1.对高抗体(OD≥2)和高BI(≥4^+)血清,增敏效果不明显,但用于中抗体(OD<2和>1)、低抗体(OD<1)和低BI(≤3^+或0)血清则增敏明显,且有随血清释度增高而增效的趋势;2.两法均高度敏感(OM在MB中阳性率100％,在PB为84％;SM在MB和PB均为100％)和特异(两法均100％地特异),但SM比OM更敏感,这使在PB中(u=2.08,p<0.05)检测低抗体有了可能;3.显色剂 TMB可望代替OPD[t=0.333(OM)和0.101(SM),p>0.05],这对保护试验者的健康有好处,4.用SM可将整个试验缩短1小时而不影响结果。作者认为SM比OM敏感、特异、简单而快速,对检测低抗体血清有相当潜力。

麻风单克隆抗体的研究:Ⅰ、抗麻风菌特异酚糖脂抗原表位的单克隆抗体的产生

用SP2/0骨髓瘤细胞与用麻风菌(ML)加酚糖脂(PGL-1)的混合抗原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,以PGL-1(后改为ND-O-BSA)及耻垢分支杆菌(Ms)为抗原做间接酶联免疫吸附计验(ELISA),发现了4株阳性(?)隆(H_2、D_(10)、C_4和G_3)。其中H_2为含抗酚糖脂抗原表位的McAb,与Ms有弱交叉,D_(10)、C_4和G_3均含抗Ms的McAb,而不与PGL-1交叉。在多瓶传代中筛取的不与Ms交叉的H_2杂交瘤细胞克隆称为H_2·。对H_2·的特性检测表明其为以IgG为主的IgG与IgM混合型McAb,初步鉴定表明除与H_(37)Rv和Mx有微弱的交叉反应外不与受试的其它分枝菌产生交叉反应。经66代培养表明是一株能持续分泌抗PGL-1抗原表位抗体的杂交瘤细胞株。关于H_2·、D_(10)、C_4和G_3的进一步研究结果将另文发表。

麻风菌早期感染检测及其主要抗原分析方法的研究

本研究的目的是建立麻风菌早期感染检测及其主要抗原分析的方法。其着眼点为把现代分子生物学方法应用于解决麻风防治工作中的难题。 1.建立了:巢式麻风菌基因扩增试验;套式结核菌基因扩增试验;

国产氟嗪酸在裸鼠体内的抗麻风菌活性

在裸鼠双后足垫皮下各接种１×１０＾４条麻风菌，９２天后各组分别给予０．０５％的国产和进口氟嗪主０．０１％的ＲＥＰ饲料，喂８８天，结果０．０５％的国产ＯＦＬＯ在停药早期有明显的抑菌活性，与０．０１％的ＲＦＰ相似，也与进口ＯＦＬＯ的抗菌效价相似，用０．１％的国产ＯＦＬＯ组，在整个实验中足垫内始终末检出麻风菌，表明该浓度的药物有强大的杀菌活性。