二氢杨梅素抑制黄嘌呤氧化酶生物活性综合评价与作用机制研究

目的揭示天然手性分子二氢杨梅素在弱碱环境中对黄嘌呤氧化酶生物活性的抑制作用及其机制。方法采用弱碱性(pH 7.5或8.5)的黄嘌呤氧化酶体外活性测试模型,对二氢杨梅素抑制黄嘌呤氧化酶生物活性能力进行评价。基于超氧阴离子自由基氧化二氢杨梅素并转化为杨梅素,进一步探究二氢杨梅素药剂抑制黄嘌呤氧化酶生物活性的作用机制。结果二氢杨梅素在pH 7.5的碱性条件下,对黄嘌呤氧化酶的抑制作用高于在pH 8.5下,最高抑制率可达48.47%。基于超氧阴离子自由基对二氢杨梅素的选择性氧化,揭示了二氢杨梅素与杨梅素分子结构对XOD生物活性抑制的协同增效作用机制,明确了黄酮类化合物平面分子结构和B环上的羟基数对XOD活性抑制具有显著贡献。结论本研究首次揭示了二氢杨梅素、杨梅素对黄嘌呤氧化酶生物活性抑制的协同增效作用,可为天然手性小分子化合物抑制黄嘌呤氧化酶研究提供参考依据。

超声辅助酶解制备大米蛋白黄嘌呤氧化酶活性抑制肽的工艺条件优化

以大米蛋白为原料,研究碱性蛋白酶酶解法制备黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD)活性抑制肽,并对其体外功能活性进行评价。研究了蛋白酶种类、底物质量分数、酶解温度、加酶量、酶解pH、酶解时间对大米蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)及酶解产物对黄嘌呤氧化酶活性抑制率的影响,探讨了不同超声处理方式对酶解过程的影响,通过响应面法对实验条件进行了优化结果为:采用碱性蛋白酶,底物质量分数5%,酶解温度为56℃,加酶量为8000 U/g,酶解pH为10,超声功率70 W,超声酶解60 min,对所制备的大米蛋白黄嘌呤氧化酶活性抑制肽的功能活性进行了评价。在最优条件下其黄嘌呤氧化酶抑制活性的IC_(50)为1.55 mg/mL,ABTS自由基清除作用、羟基自由基清除作用、DPPH自由基清除作用的IC_(50)值分别为0.49、12.48、3.88 mg/mL。

土茯苓中黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选鉴定研究

目的采用磁珠固定化酶和LC-MS/MS联用技术快速筛选土茯苓中的黄嘌呤氧化酶抑制剂,明确土茯苓中的降尿酸活性成分。方法以羧基磁珠作为载体通过共价偶联制成固定化黄嘌呤氧化酶。以固定化酶的特异性吸附作用对土茯苓中的黄嘌呤氧化酶抑制剂进行亲和筛选,以LC-MS/MS和对照品进行分析对比,并对筛选鉴定出的成分进行抑制活性和抑制类型进行考察。结果扫描电镜和红外光谱表征了固定化黄嘌呤氧化酶的成功合成,酶固载量为70.50μg/mg,相对活力为79.44%。从土茯苓提取物中共筛选出13个活性化合物,并鉴定了11个成分。酶活性试验表明黄杞苷和异黄杞苷的抑制活性最强,与阳性对照别嘌呤醇接近,其IC_(50)值和抑制类型分别为32.25μg/mL、混合型抑制,35.12μg/mL、竞争性抑制。结论本方法直接从土茯苓提取物中筛选鉴定具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的成分,简单、快速、准确,适用于复杂中药体系中黄嘌呤氧化酶抑制剂的高通量筛选。

荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴不同器官组织中黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的mRNA表达差异的比较

目的比较荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤脱氢酶氧化酶(XDH/XO)的mRNA的相对表达量的差异,为改进实验研究方法学提供参考依据。方法提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总RNA,使用相同的引物序列及内参基因,分别用荧光定量PCR与半定量PCR进行相对定量检测,结果做比对分析。结果两种检测方法均能检测到健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中XDH/XO的mRNA表达,荧光定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织0.4ng总RNA中的XDH/XO的mRNA表达,半定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织15.625 ng总RNA中的XDH/XO的mRNA表达,荧光定量PCR较半定量灵敏度高39倍。两种方法检测结果均显示猕猴不同组织XDH/XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平最高,对于表达量较低的其他组织,荧光定量PCR与半定量PCR检测结果存在有一定差异。结论两种方法均可用于检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶(XDH/XO)的mRNA的相对表达量,荧光实时定量PCR灵敏度较高于半定量PCR法。

糖尿病大鼠睾丸组织黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和线粒体琥珀酸脱氢酶的变化和灵芝孢子粉的干预

目的:探讨糖尿病大鼠睾丸组织黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)的变化及灵芝孢子粉对睾丸组织的保护作用。方法:将清洁级Wistar大鼠50只,随机分成3组(对照组10只、模型组20只、灵芝孢子粉组20只)。模型组及灵芝孢子粉组以25mg/kg的剂量一次性腹腔注射2%链脲佐菌素,对照组腹腔注射等量柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。正常饮食喂养2周后,进行糖耐量试验,模型组和灵芝孢子粉组糖耐量异常者保留,余去除,并改喂高脂高糖饮食,灵芝孢子粉组另加灵芝孢子粉[250mg/(kg.d)]持续10周,动物均单独喂养,实验结束前1d做糖耐量试验,取睾丸。检测睾丸组织XOD、MPO和线粒体SDH。结果:模型组睾丸组织的SDH较对照组和灵芝孢子粉组明显降低(P<0.05),而XOD和MPO明显高于对照组和灵芝孢子粉组(P<0.05)。模型组生精小管层次不清,精子生成量减少或消失,管腔不规则,腔周围纤维组织(间质)增生,基膜增厚,血管壁纤维组织样增生硬化。灵芝孢子粉组生精小管层次比较清析,管腔规则,有大量精子生成,间质无增生,血管基膜增生硬化不明显。结论:灵芝孢子粉能减少自由基对睾丸组织的损伤,提高SDH活性,从而对糖尿病大鼠睾丸组织起保护作用。

猕猴不同组织器官中黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的mRNA表达的半定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立半定量RT-PCR检测方法检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶(XDH/XO)的mRNA的表达。方法分别提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总RNA,用RT-PCR二步法进行XDH/XO基因片段扩增,内参基因选用管家基因GAPDH,对获得的目的片段进行序列测定以鉴定其特异性,在凝胶影像分析仪Quantity one软件得出其电泳条带的灰度值(IOD),计算目的基因与内参基因比值得到猕猴不同组织XDH/XO的mRNA的相对表达量。结果建立了半定量RT-PCR检测方法,猕猴不同组织XDH/XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平最高,其次为心肌,肾脏,睾丸,皮肤。结论本研究所建立的半定量RT-PCR检测方法可应用于检测猕猴各组织器官组中的XDH/XO的mRNA的表达差异。

大鼠门静脉高压症及梗阻性黄疸时细菌移位与黄嘌呤脱氢酶和黄嘌呤氧化酶的关系

目的探讨大鼠门静脉高压症(portal hypertension,PH)及梗阻性黄疸(obstructive jaundice,OJ)时,细菌移位(bacterial translocation,BT)与黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)、黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase,XD)之间的关系。方法将雄性SD大鼠60只随机分为对照组(A组),胆总管结扎组(B组)和门静脉缩窄组(C组),每组20只。术后第3周取肠系膜淋巴结、脾、肝组织及门静脉、腔静脉血细菌培养,测定门静脉压力(free portal pressure,FPP),及肠XO,XD活性水平。结果B组及C组细菌移位率明显高于对照组(P<0.01),对照组为12%,B组和C组分别为28%和54%;B组和C组空肠XO水平活性明显高于对照组(P<0.01),B组和C组门静脉压力也较对照组升高。细菌移位率与XO活性成正相关(r=0.603)。XD活性水平无显著差异。结论门静脉高压症及梗阻性黄疸时可发生细菌移位,可能与肠黏膜屏障被破坏通透性增强有关,肠壁XO水平活性增强引起肠黏膜屏障通透性增高有助于细菌移位发生。

土茯苓中抑制黄嘌呤氧化酶活性成分提取工艺优化及其酶动力学研究

目的优化土茯苓中抑制黄嘌呤氧化酶活性成分提取工艺,并考察其酶动力学。方法在单因素试验基础上,以乙醇体积分数、提取时间、提取温度为影响因素,黄嘌呤氧化酶活性抑制率为评价指标,响应面法优化提取工艺。分别通过Lineweaver-Burk图、Dixon图确定其抑制类型、抑制动力学常数K i。结果最佳条件为乙醇体积分数69%,提取时间89 min,提取温度82℃,黄嘌呤氧化酶活性抑制率为62.25%。抑制类型为竞争性可逆抑制,K i为1.92 mg/mL。结论该方法稳定可靠,可用于提取土茯苓中抑制黄嘌呤氧化酶活性成分。

豨莶草对黄嘌呤氧化酶和环氧合酶-2双重抑制作用的虚拟筛选

目的探究豨莶草对黄嘌呤氧化酶(XOD)和环氧合酶-2(COX-2)具有双抑制活性成分及结合机制。方法由TCMSP数据库筛选得出豨莶草所含化合物成分,以黄嘌呤氧化酶、环氧合酶-2为目标,使用Autodock Tools软件对化合物进行虚拟筛选,并使用Pymol软件针对代表性活性成分与黄嘌呤氧化酶、环氧合酶作用模式进行分析。结果豨莶草所含的活性成分与黄嘌呤氧化酶的结合能,在-5.0 kcal·moL^(-1)以下的有5种化合物,与环氧合酶-2的结合能,在-5.0 kcal·moL^(-1)以下的有9种化合物。根据分子间作用力来看,豨莶草中的豆甾醇、豨莶精醇对这两种蛋白的活性位点有氢键相互作用和疏水相互作用。结论豨莶草中的豆甾醇、豨莶精醇成分可能对黄嘌呤氧化酶和环氧合酶-2有双重抑制的效果。

RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平方法的建立

目的建立实时荧光定量(RT-qPCR)检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的方法,以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。方法提取Wistar大鼠肝脏组织中总RNA,经逆转录得到cDNA,以10倍为稀释因子稀释为5个浓度梯度,使用设计的引物序列和内参基因进行RT-qPCR检测,得到XDH/XO基因表达的标准曲线。进而检测Wistar大鼠高尿酸血症动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结果 RT-qPCR法检测得到的XDH/XO基因标准曲线溶解峰单一,R^2接近1,能检测出高尿酸动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结论 RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法具有定量准确,重复性好的特点,可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面。

带鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽制备及工艺优化

目的制备带鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽,研究含肌肽类活性肽的带鱼提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。方法以带鱼为原料,通过超声辅助酶法制备带鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽,高效液相色谱法测定肌肽类活性肽的含量。结果以肽粉得率和黄嘌呤氧化酶抑制率为指标,筛选得到碱性蛋白酶为最佳反应用酶。以单因素实验为基础,通过Box-Behnken响应面分析法,以水解度、黄嘌呤氧化酶抑制活性、肌肽及鹅肌肽含量为响应值,优化得到酶解最优条件:酶解时间5 h,超声时间21 min,酶解温度49℃。在此条件下,得出水解度21.90%、黄嘌呤氧化酶抑制率52.03%、鹅肌肽含量0.66%和肌肽含量为0.15%,与回归理论模型基本符合。在最优酶解方案的基础上,将酶解液进一步分成不同组分,可得到肌肽类活性肽含量升高,抑制活性变大。结论肌肽类活性肽对黄嘌呤氧化酶活性的抑制有着积极的作用,这为工业化利用带鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽提供理论及指导。

微小隐孢子虫次黄嘌呤核苷酸脱氢酶抑制剂的虚拟筛选

为开发新型抗隐孢子虫病药物,本研究采用Autodock和GOLD两种软件,通过计算机虚拟筛选方法,将21种已报道的具有抗隐孢子虫作用的化合物与微小隐孢子虫次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(CpIMPDH)和人源IMPDH(IMPDH2)进行对接。综合分析并推测山莴苣素17有望成为CpIMPDH选择性抑制剂,后续工作将以此为基础对山莴苣素17开展进一步的验证性试验。通过计算机虚拟筛选可以减少试验的盲目性,节省人力、物力,加快新兽药的开发进程。

乳源黄嘌呤脱氢酶和黄嘌呤氧化酶的晶体结构研究概述

在全球范围内,高尿酸血症近年来发病率逐渐提高。黄嘌呤脱氢酶(XDH)、黄嘌呤氧化酶(XO)等是参与痛风发生与发展的关键酶,是开发抗痛风药物的重要靶标。通过抑制嘌呤代谢关键酶活性,可有效降低血浆尿酸水平。本文主要概述了在2.1-分辨率下牛乳来源的二聚XDH的晶体结构及在2.5-分辨率下XO的晶体结构,发现每个分子由一个含两铁硫中心的氨基端20 kDa域、一个中央40 kDa黄素腺嘌呤二核苷酸域和一个85 kDa钼喋呤结合域。此外,对黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶的主要变化历程进行概述。

2-苯基-四氢噻喃并嘧啶类化合物的合成及黄嘌呤氧化酶抑制活性

以4-羟基苯甲腈为原料,经醚化、水解、酰化、加成等反应,共合成12个新型的2-苯基-四氢噻喃并嘧啶类化合物(6a^6d,8a^8h),并进行抑制黄嘌呤氧化酶活性测试。结果表明:化合物8a^8h(100μmol/L)均表现出不同程度的抑酶活性,其活性明显强于化合物6a^6d,即嘧啶环上引入羧基有利于提高抑酶活性;在化合物8a^8h中,以嘧啶环上异丙酸取代,苯环羟基乙醚化的8f活性最强,IC50为76.0μmol/L。

马鲛鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备工艺优化及抗氧化活性研究

目的 探究马鲛鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽制备的最佳条件及其抗氧化活性。方法 以马鲛鱼为原料,黄嘌呤氧化酶抑制肽采用超声辅助酶法制备,并筛选最佳反应用酶;以单因素实验为基础,通过Box-Behnken响应面分析法,以黄嘌呤氧化酶抑制活性为响应值,优化得到酶解最优条件。通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除等方法测定膜分离物的抗氧化活性。结果 最佳反应用酶为复配的中性蛋白酶与复合蛋白酶(1:1, m:m)。优化所得的最佳酶解条件为:酶解温度50℃,加酶量为0.2%, pH为7.0。在此条件下黄嘌呤氧化酶抑制率37.49%,与回归理论模型基本符合。3个组分的膜分离物中,相对分子量小于1 kDa的酶解产物的抗氧化性能力最强。结论 本研究制备的黄嘌呤氧化酶抑制肽对黄嘌呤氧化酶有较好的抑制作用,且抗氧化性良好,为工业化制备马鲛鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽提供了数据基础和理论依据。

青占鱼黄嘌呤氧化酶抑制肽制备工艺优化

目的 优化青占鱼黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)抑制肽的制备工艺。方法 以青占鱼为原料,选用5种蛋白酶对其水解制备XOD抑制肽,测定XOD抑制率和水解度并用以评价效果,通过单因素和响应面分析相结合的实验方法优化酶解条件,最后对其分子量分布情况进行了检测分析。结果 复配酶制剂为最适酶,最佳酶解工艺为:加酶量4000 U/g、酶解时间4 h、酶解温度55℃、pH 7.0、料液比1:2 (g/mL);同时测得最优工艺下XOD抑制率和水解度的实际值分别为68.22%和19.15%,与理论值基本无差别。采用该法制备的青占鱼XOD抑制肽分子量分布情况为:5500~3000Da的肽段占比56.44%,3000~1500Da的肽段占比31.07%,<1500Da的肽段占比12.49%,均在5500Da以下,证明表达生物活性的是小分子肽。结论 本研究可为青占鱼制备XOD抑制肽的生产工艺与机制研究提供一定的技术参考与理论支持。

麻风病人自由基代谢紊乱与黄嘌呤氧化酶过氧化氢酶的活性变化

采用分光光度法测定黄嘌呤氧化酶及过氧化氢酶的活性,分析酶活性与麻风病人体内自由基代谢紊乱的关系。结果显示麻风病人(活动期和愈复期)与正常人比较,黄嘌呤氧化酶活性的差异无显著意义(P>0.05),说明病人体内自由基代谢紊乱与黄嘌呤氧化酶无关;然而愈复期病人(其麻风菌已被抗麻风药物杀灭)过氧化氢酶增加,甚至超越正常水平(P<0.05)。

耐辐射异常球菌黄嘌呤脱氢酶在氧化胁迫反应中的作用

黄嘌呤脱氢酶广泛分布在真核生物、细菌和古细菌中,是催化氧化嘌呤、蝶啶和醛类等多种杂环分子的氧化还原酶类,与氮同化、激素代谢、衰老的调控及活性氧产生等过程相关。耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans R1)具有超强的氧化胁迫抗性和氧保护机制,其基因组含有完整的黄嘌呤脱氢酶编码基因xdhABC。为探究该酶的功能,构建了xdhA缺失突变株,通过比较分析突变株ΔxdhA与野生型菌株对嘌呤代谢及甲醛敏感性,确定xdhABC编码蛋白为黄嘌呤脱氢酶。氧化胁迫(60 mmol·L^(-1)H_(2)O_(2))条件下,菌株生存率以及氧保护相关基因表达的差异分析结果表明,ΔxdhA生存能力较野生型低2个数量级;氧化胁迫反应相关基因表达下调。另外,酶活分析也表明,H_(2)O_(2)冲击条件下xdhA突变导致细胞内总抗氧化能力下降。推测D.radiodurans R1黄嘌呤脱氢酶在氧化胁迫反应中发挥重要作用。

秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺优化

为探讨秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶(XOD,xanthine oxidase)抑制肽的最佳工艺,该文以氮回收率和体外XOD抑制活性为指标,首先通过单因素试验确定中性蛋白酶和胰酶为水解秋刀鱼制备XOD抑制肽的最佳蛋白酶。在此基础上,采用响应面分析法研究加酶量、酶解时间和中性蛋白酶所占比例对酶解氮回收率及酶解产物XOD抑制活性的影响,进一步优化并最终确定了水解秋刀鱼制备XOD抑制肽的最优工艺:料液比1∶2(g/g),总加酶量0.3%(中性蛋白酶∶胰酶质量比=6∶4),在p H值7.0和55℃条件下酶解6 h,其理论氮回收率和酶解产物XOD抑制率分别为72.69%和30.32%,对应实际值分别为72.03%和30.96%,预测模型可靠性高,可用于秋刀鱼XOD抑制肽的酶法制备,为工业化利用秋刀鱼生产降尿酸肽提供一定的理论和技术指导。