黄地老虎颗粒体病毒cDNA文库的构建

以感染黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum ganulosis virus,AsGV)的黄地老虎幼虫为材料提取总RNA、分离mRNA,并反转录合成cDNA,构建了包括黄地老虎(Agrotis segetum,As)幼虫和黄地老虎颗粒体病毒的cDNA文库。用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶酶切AsGV基因组DNA,制备地高辛探针,与上述总RNA、mR-NA、cDNA杂交,从文库中筛选出AsGV的阳性克隆1081个,经cDNA测序,cDNA编码序列与基因组编码序列相符。并根据基因组阅读框序列合成引物,PCR扩增出59个阅读框的编码基因,也完全与基因组序列相符。

黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究

增效蛋白(ENHANCIN)是一种主要在昆虫杆状病毒中存在的杀虫增效因子,黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulovirus,AgseGV)基因组中有一个ORF的编码产物为杆状病毒ENHANCIN同源物,命名为en-hancin-like。生物信息学分析结果表明,AgseGV的enhancin-like基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,在其C-末端拥有类似哺乳动物的脯氨酸富集区。为了确定AgseGV的EN-HANCIN-like蛋白是否具有增效功能,构建了AgseGV的enhancin-like全基因和5′端片段(1 017bp)的原核表达载体。利用层析技术纯化截短片段的原核表达产物,以其为抗原制备了抗体。利用自制抗体和His-tag抗体,Western blot检测了enhancin-like全基因的表达产物。结果表明,在融合蛋白预期大小处显示出阳性条带,证明目的基因得到了良好的表达。以棉铃虫为供试虫进行生物测定,证明在棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)浓度为1.17×102 PIBS/mL时,AgseGV enhancin-like的全基因原核表达产物能使其感染3龄初幼虫的死亡率提高16.25%,增效作用显著。但是,5'端截短片段的原核表达产物对HaNPV没有增效作用。