基于核酸杂交反应的荧光生物传感器的制备及在黄曲霉毒素B_1检测中的应用

采用核酸适配体作为特异性识别元件,SYBR Green I(SGI)荧光染料为信号输出单元,构建了黄曲霉毒素B_1(AFB_1)生物传感器,并对试验条件进行了优化。优化的试验条件如下:适配体互补链与适配体的物质的量比为1.5,SGI加入量为10μL,适配体双链与SGI的作用时间为2 min,适配体与AFB_1作用时间为14 min。结果表明,在AFB_1质量浓度为0.1~1 000μg·L^(-1)时,荧光强度变化量与其质量浓度对数呈线性关系,检出限(3S/N)为0.081μg·L^(-1)。对实际玉米样品进行加标回收试验,回收率为95.2%~105%,测定值的相对标准偏差(n=7)均小于6.0%。与其他适配体传感器进行比较,该方法所构建的荧光适配体传感器对AFB_1的检测具有操作简便、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、成本低廉等优点,适合现场快速测定。

基于纳米抗体的可再生免疫亲和柱结合高效液相色谱-串联质谱法测定玉米中的黄曲霉毒素B_(1)

目的研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxinB_(1),AFB_(1))纳米抗体的表达产量的影响因素,开发具有可再生性的AFB_(1)免疫亲和柱,构建免疫亲和处理-高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定玉米中AFB_(1)污染的分析方法。方法研究诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度等对AFB_(1)纳米抗体表达量的影响,比对验证AFB_(1)纳米抗体可再生免疫亲和柱的耐受性和可再生使用次数。使用70%甲醇水溶液提取玉米样品中AFB_(1),提取液通过免疫亲和柱净化富集后进行HPLC-MS/MS检测,最后进行方法学验证并应用到实际样品检测。结果诱导AFB_(1)纳米抗体表达的最优条件分别为诱导温度16℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间14 h,在最优条件下产量可达7.8 mg/L。AFB_(1)纳米抗体具有良好灵敏度、亲和性、特异性和甲醇耐受性,制备的AFB_(1)免疫亲和柱具有极好的可再生性,重复使用150次以上,对AFB_(1)回收率仍可达80%以上。同时,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS,在0.1~100.0μg/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.014μg/L,定量限为0.047μg/L。在3个不同加标浓度下,回收率在92.0%~104.1%,变异系数小于3.9%。结论本研究开发的AFB_(1)纳米抗体免疫亲和柱表现出优秀的再生性和高特异性,节约了检测成本,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS检测方法操作简便、回收率高、结果准确,适用于实际玉米样品中AFB_(1)的含量测定。

黄曲霉毒素B_(1)降解菌株的分离鉴定、发酵条件的优化及活性组分分析

为筛选出一株高效降解黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))的菌株,选取土壤为菌株来源,进行富集培养,经过以香豆素为唯一碳源的初筛和添加AFB_(1)的复筛后,对筛选得到的各菌株进行16S rDNA鉴定,比对其测序结果,选取降解AFB_(1)最高的菌株,探究发酵时间、发酵温度、初始pH、接种量、培养基对菌株降解AFB_(1)的影响规律,通过正交试验优化发酵条件,并对降解方式进行初步探索。结果表明:经过初筛和复筛得到7株能够降解AFB_(1)的菌株,经鉴定均为伯克霍尔德菌属,其中Burkholderiasp.D6的AFB_(1)降解率最高;最优发酵条件为以LB培养基为发酵培养基、发酵时间84h、发酵温度37℃、初始pH 7.0、接种量10%,在此条件下Burkholderiasp.D6对AFB_(1)的降解率为(87.91±2.32)%;初步判断降解AFB_(1)的活性组分是蛋白质或者酶。综上,通过筛选得到了一种能够高效降解AFB_(1)的菌株,蛋白质或酶参与了AFB_(1)的降解。

益生菌对黄曲霉毒素B_(1)的降解作用及其在家禽生产上的应用

黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)主要存在于污染粮油及其制品中,常见的有AFB_(1)、AFB_(2)、AFG_(1)和AFG_(2)四种类型,以黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))毒性最强,对全球农业和食品安全造成极大危害。目前,常用的缓解AFB_(1)毒性的方法包括物理法、化学法和生物法,其中生物脱毒法中,益生菌作为绿色无污染的添加剂成为研究的热点。本文综述了黄曲霉毒素对家禽的危害,列举了对黄曲霉毒素具有降解作用的益生菌,阐述了益生菌的解毒机制以及在禽类生产中的应用,以期为利用益生菌降解AFB_(1)的研究及应用提供借鉴和指导。

白藜芦醇对黄曲霉毒素B_(1)致兔肾脏损伤的保护作用

【目的】探究白藜芦醇(resveratrol,Res)对黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))致兔肾脏损伤的保护作用。【方法】将21只40日龄的家兔随机分为3组,每组7只,分别为对照组、AFB_(1)组和AFB_(1)+Res组,其中对照组饲喂基础饲粮,AFB_(1)组饲喂含0.3 mg/kg BW AFB_(1)的基础饲粮、AFB_(1)+Res组饲喂含0.3 mg/kg BW AFB_(1)和30 mg/kg BW Res的基础饲粮,试验期21 d。试验结束后观察家兔肾脏组织病理变化,检测血清中肌酐(creatinine,CRE)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)和尿酸(uric acid,UA)含量,检测肾脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量/活性。【结果】与对照组相比,AFB_(1)组家兔肾脏可见肾小囊腔扩张、肾小管上皮细胞排列紊乱、细胞核模糊和脱落,且肾脏中糖原沉积增多;血清中CRE、BUN和UA含量均显著升高(P<0.05);肾脏组织中GSH-Px、SOD活性和T-AOC均显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05)。与AFB_(1)组相比,AFB_(1)+Res组家兔肾脏组织结构损伤得到缓解,且糖原沉积减少;血清中CRE、BUN和UA含量均显著降低(P<0.05);肾脏组织中GSH-Px、SOD活性和T-AOC均显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。【结论】饲料中添加Res可以通过提高兔肾脏抗氧化能力、调节氧化应激水平而有效缓解AFB_(1)引起的兔肾脏损伤。

不同层电荷数钙蒙脱石对黄曲霉毒素B_(1)的吸附性能与机理研究

以内蒙古、新疆及辽宁三地的钙基膨润土为研究对象,探究不同层电荷数钙蒙脱石对黄曲霉毒素B1(AFB_(1))的吸附性能与机理。采用X射线衍射仪、红外光谱仪、高效液相色谱仪等测试手段,研究不同产地膨润土的矿物学属性、理化性能及钙蒙脱石吸附AFB_(1)的动力学和等温吸附作用。结果表明,钙蒙脱石含量高、比表面积大、层电荷数高的内蒙古膨润土(N-Mt)吸附性能较好,当初始浓度为1.5 mg/L、吸附剂用量为5 mg时,N-Mt对AFB_(1)的饱和吸附量为1.153 mg/g,吸附过程受pH值影响较小。钙蒙脱石对AFB_(1)的吸附行为同时符合准一级动力学模型和准二级动力学模型,表明吸附过程可能同时涉及物理吸附和化学吸附。钙蒙脱石与AFB_(1)之间的吸附作用同时发生在层间域和层面上,该作用主要源于电子供体-受体结合作用和钙蒙脱石与AFB_(1)分子之间的离子-偶极相互作用。钙蒙脱石对AFB_(1)的等温吸附符合Langmuir模型,属单分子层吸附。

基于激光诱导荧光光谱技术检测花生中黄曲霉毒素B_(1)

目的探究激光诱导荧光(laser induced fluorescence,LIF)技术检测花生中黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))的可行性,定性和定量分析花生中的AFB_(1)。方法制备不同浓度梯度的污染花生,经LIF系统采集荧光光谱,平滑后分析光谱数据结构。基于全波长光谱使用5种不同建模方法对污染花生定性判别,采用偏最小二乘法回归(partial least squares regression,PLSR)和BP神经网络(BP neural networks,BPNN)进行定量预测。通过竞争性自适应重加权采样(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)提取特征波长,研究其对定性和定量预测的影响。结果对于全波长光谱数据,线性核函数的支持向量机[support vector machine with linear kernel function,SVM(Linear)]建立的判别模型效果最优,预测正确率100.00%。PLSR和BPNN均获得较好的定量预测效果,剩余预测偏差(residual predictive deviation,RPD)>3.0,检出限(limit of detection,LOD)<20μg/kg;对于特征光谱数据,SVM(Linear)定性判别预测正确率93.94%,F1值为0.94,受试者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.989。建立的PLSR模型性能优于未提取特征波长的两种定量模型,RPD为3.36,LOD为14.76μg/kg。结论LIF技术检测花生中的AFB_(1)简单快速,定性定量预测模型准确性好,具有一定可行性。

基于胶体金-适配体的层析试纸条检测玉米中黄曲霉毒素B_(1)

黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))因其剧毒性及在粮食中分布广泛而成为人类健康和粮食安全的重大风险因素之一,因此建立快速、灵敏的检测方法十分必要。利用胶体金和适配体作为金标探针,构建一种新型层析试纸条以实现玉米中AFB_(1)的快速检测。根据体系中AFB_(1)存在会减弱生物素标记的适配体与金标探针的结合,从而导致试纸条检测线的颜色强度降低或消失,进而实现对AFB_(1)高效灵敏检测。在最佳条件下,试纸条检测AFB_(1)的检出限值低至0.5 ng/mL,在0.5~500 ng/mL范围内快速准确检测且对AFB_(1)具有高度的特异性。本研究制备的适配体试纸条能够成为玉米中AFB_(1)检测的有效方法,具有良好的应用前景。

聚苯胺功能化的塑料光纤传感器用于黄曲霉毒素B_(1)浓度检测

为开发低成本高灵敏度黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))检测设备,研制了一种将聚苯胺(PAni)与塑料光纤(POF)相结合的增敏光纤免疫传感器。传感器功能化设计采用两步法,首先将PAni涂层修饰至光纤传感区,然后通过戊二醛的交联作用,将AFB_(1)抗体分子固定于传感区。由于测量过程中抗原和抗体的免疫反应会导致POF表面折射率发生变化,从而引起探测光子数的波动,以此实现对AFB_(1)浓度的检测。实验研究了PAni涂层对传感器的增敏效果,结果表明PAni功能化的POF传感器增敏效果明显,且在0.01~10μg/L AFB_(1)浓度范围内,传感器的光子数变化量与AFB_(1)浓度间具有线性关系,检测限为0.53μg/L,加标回收率为95.97%~113.13%,且传感器对AFB_(1)的特异性和抗干扰性良好,满足AFB_(1)精量化检测的需要。

降解黄曲霉毒素B_(1)菌株的筛选鉴定及降解条件优化

【目的】从分离源中筛选得到黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))高降解率的菌株并进行鉴定,优化菌株降解AFB 1的条件。【方法】以青贮饲料、泡菜液及腌酸菜为分离源,以香豆素为唯一碳源的培养基进行菌株初筛。采用高效液相色谱法检测AFB_(1)含量,以高AFB_(1)降解率进行复筛,对所得菌株进行鉴定,确定菌株名称。以AFB_(1)降解率为指标,探明发酵时间、初始pH、接种量及AFB_(1)浓度对菌株降解AFB_(1)的影响,通过正交试验进行降解条件优化。【结果】初筛共筛选出16株可以利用香豆素的菌株,复筛时QC7有最高降解率,为86.00%,经鉴定为空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)。当AFB_(1)质量浓度为0.2μg/mL时,其最优降解条件为发酵时间72 h、初始pH 6.5、接种量5%。最高降解率为89.41%。【结论】筛选得到了对AFB_(1)有较佳降解能力的菌株,通过条件优化,提高了菌株对AFB_(1)的降解率,为后续降解机制探究提供了基础。

鸡骨草黄酮对黄曲霉毒素B_(1)诱导雏鸡肝损伤的缓解作用

研究旨在探讨鸡骨草黄酮(ACE)能否减轻黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))诱导的肝毒性作用,为临床防治AFB_(1)引起的肝损伤提供新思路。选择健康三黄鸡60羽,随机分为3组,每组4个重复,每个重复5只鸡。空白对照组(NC组)饲喂基础日粮,AFB_(1)组饲喂基础日粮+2.8 mg/kg AFB_(1),ACE组饲喂基础日粮+2.8 mg/kg AFB_(1)+1 g/kg ACE。试验期7 d。结果显示,与NC组相比,AFB_(1)组雏鸡14日龄体重、肝脏谷胱甘肽转移酶(GST)表达量以及肝脏过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低(P<0.05),雏鸡血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰转肽酶(GGT)活性及肝脏丙二醛(MDA)含量、肝脏细胞色素P450酶1A2 (CYP1A2)表达量显著升高(P<0.05)。与AFB_(1)组相比,ACE组雏鸡14日龄体重、肝脏GST表达量以及CAT、SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),雏鸡血清AST、ALT、ALP和GGT活性及肝脏MDA含量、肝脏CYP1A2表达量显著下降(P<0.05)。研究表明,日粮补充ACE可能通过增强抗氧化能力和抑制关键的细胞色素P450酶(CYP450)同工酶介导的AFB1对有毒产物AFB1-8,9-环氧化物(AFBO)的激活,起到协同作用,从而保护雏鸡免受AFB1诱导的肝损伤。

用于黄曲霉毒素B_(1)快速检测的胶体金试剂盒质量评价

为评估黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))胶体金快速检测试剂盒性能,对6个胶体金快速检测试剂盒生产厂家的产品进行质量评价。以大豆油为基质,通过人为加入标准物质的方法制备盲样,对6个生产厂家的试剂盒组成、前处理过程、显色情况、性能指标、检测时间等进行评价,并将其用于国家及河南省抽检食用油样品的检测。结果表明,6个生产厂家的试剂盒组成完整,前处理快速,易操作,检测时间短(均在25 min以内),但合格率仅50%,有3个生产厂家的试剂盒因较高的假阴性率而不达标。由此可知,质量优良的快速检测试剂盒能很好地满足实际样品检测需求,但目前市场上的快速检测试剂盒整体质量还有待提升,生产企业应严格按照国家相关标准进行研发和生产,同时国家相关部门要继续完善评价体系,加强监管。

高效液相色谱-串联质谱法测定玉米蛋白粉中黄曲霉毒素B_(1)测量不确定度评定

采用GUM法和Top-down法对高效液相-串联质谱法测定玉米蛋白粉中的黄曲霉毒素B_(1)测量不确定度进行评定。通过比较2种方法的评定过程和评定结果发现,Top-down法在简化评定步骤、保证评定结果可靠性的前提下,能够充分利用实验室检测数据和质量控制数据,引入检测人员变动、检测仪器更换等带来的不确定度,是一种客观、高效的不确定度评定方法,为饲料中黄曲霉毒素B_(1)检测数据准确溯源提供参考。

基于壳聚糖微球的黄曲霉毒素B_(1)免疫亲和柱开发制备

目的基于壳聚糖微球制备用于黄曲霉毒素B_(1)检测前处理的免疫亲和柱。方法通过优化化学交联法的反应条件,包括壳聚糖分子量、氨基和醛基摩尔比、壳聚糖浓度和水相油相比,制备粒径大小合适且均一的壳聚糖微球,并以此为载体偶联黄曲霉毒素B_(1)的单克隆抗体制备免疫亲和柱。对亲和柱性能进行分析,使用阳性实际样品对亲和柱使用效果进行验证。结果在最佳制备条件下免疫亲和柱非特异性吸附率为5.26%,对单克隆抗体偶联率为90.90%,柱容量为2.69μg AFB_(1)/mL壳聚糖微球,检测回收率为92.12%~98.62%,相对标准偏差为0.61%~2.53%。用于实际样品检测回收率为87.90%~96.37%。结论本研究建立的免疫亲和柱制备过程简单、成本低,为黄曲霉毒素B_(1)痕量检测前处理提供一种新的方案。

食用植物油中黄曲霉毒素B_(1)检测质量控制方法研究

黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))是毒性最强的黄曲霉毒素,植物油生产过程中易受到霉菌的感染而导致黄曲霉毒素B1超标,因此对人类健康造成潜在的威胁。本文通过阐述食用油中黄曲霉毒素B1检测方法、免疫亲和柱、检测仪器、质控样的选择等重要质控要点,提出了质量关键控制要点和应采取的具体方法。同时提出了通过加强人员培训及监督、优化岗位设置和重视结果反馈和跟踪改进三方面提高黄曲霉毒素B1检测质量和效率,以期为人员的培训、人员监督、质量监控等方面提供参考方法。

黄曲霉毒素B_(1)胶体金免疫层析试纸条的制备及性能研究

以黄曲霉毒素B_(1)为研究对象,制作出一种可实现对黄曲霉毒素B_(1)含量快速检测的胶体金试纸条。实验采用竞争抑制法,基于试纸条的层析作用,以胶体金为标记物与黄曲霉毒素B_(1)单抗偶联,将黄曲霉毒素B_(1)抗原和羊抗鼠二抗固定到硝酸纤维膜上作为检测线和质控线,制备出可以快速检测黄曲霉毒素B_(1)的免疫层析试纸条。通过优化,试纸条在37℃条件下,分别在5,10,15,20 d后测试,效果没有明显降低,检测灵敏度为20 ng/mL;与磺胺类药物、“瘦肉精”类药物均无交叉反应。该试纸条具有良好的稳定性和特异性,可实现生物样本中黄曲霉毒素B_(1)的快速大量检测。

基于适配体的纳米金比色法检测中药材中黄曲霉毒素B_(1)

中药材贮存加工过程中易受真菌毒素污染,其中黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))以其高毒性和致癌性备受关注。制备了金纳米粒子作为基质,采用核酸适配体作为特异性识别探针,构建了一种快速可视化检测中药材中AFB_(1)的方法。该方法检测AFB1的线性范围为2.5~100 ng/mL,检出限为1.87 ng/mL。应用该方法测定麦芽、决明子、三七中AFB_(1)的含量,加标回收率为89.1%~109.7%,相对标准偏差为3.0%~8.3%。结果表明本方法具有良好的选择性和准确性。

高效液相色谱法定量分析食用油中的黄曲霉毒素B_(1)

目的:建立高效液相色谱测定食用油中黄曲霉毒素B_(1)的方法。方法:样品用甲醇水提取,经黄曲霉毒素B_(1)免疫亲和柱净化,用甲醇洗脱,洗脱液用柱后碘衍生法上机测定。结果:该方法线性回归方程为Y=27 217.3X,相关系数R~2=0.999 6,回收率在96.8%~101.2%,方法重复性的RSD为0.6%,质控样的Z值为0.5,检出限为0.029μg·kg^(-1),定量限为0.098μg·kg^(-1)。结论:该方法线性关系良好,回收率优良,质控样、检出限、定量限均符合要求,具有简单、快速、高效、节约试剂耗材的特点。

HPLC-柱后光化学衍生法检测芝麻酱中黄曲霉毒素B_(1)

本文建立了HPLC-柱后光化学衍生-荧光检测器测定芝麻酱中黄曲霉毒素B_(1)的方法。结果表明,黄曲霉毒素B_(1)在0.0774~1.9345 ng·mL^(-1)线性关系良好,线性系数为0.9999,加标回收率为100.81%~105.46%,相对标准偏差为0.48%,定量限为0.029μg·kg~(-1),检出限为0.01μg·kg~(-1)。该方法的前处理过程简单方便,结果准确,可用于芝麻酱中黄曲霉毒素B_(1)的批量快速检测。

高效液相色谱质谱法测定葵花籽中黄曲霉毒素B_(1)的测量不确定度评定

本试验采用HPLC-MS/MS法检测葵花籽中黄曲霉毒素B 1的不确定度,研究了不确定的主要来源。结果表明:当葵花籽中黄曲霉毒素B_(1)含量为0.097μg/kg时,扩展不确定度为0.016μg/kg(k=2),不确定度的来源主要是移液定容。