饲喂黄曲霉毒素B_1对奶山羊乳中黄曲霉毒素M_1分泌规律与转化率的影响

为研究饲粮中添加单一剂量黄曲霉毒素 B1（ AFB1）后奶山羊乳中黄曲霉毒素 M1（AFM1）的分泌规律及AFB1转化为AFM1的转化率,选择3只健康、体重接近的泌乳中期关中奶山羊,每只羊饲喂1 mg AFB1。饲喂后0、4、8、24、32、48、56、72、80、96、104及120 h采集羊乳,测定AFM1含量。结果表明：1）饲喂AFB1前（0 h）,羊乳中未检出AFM1,但是饲喂AFB1后4 h,在收集的羊乳中均检出了AFM1；2）3只试验在羊乳中AFM1含量存在差异,但是其分泌规律非常相似,均呈先升高后急剧下降再缓慢下降的趋势；3）羊乳中 AFM1的峰值出现在饲喂AFB1后4～8 h；4）羊乳中 AFM1平均含量在56 h 时为0.39μg/kg,低于我国限量值（0.5μg/kg）,到120 h平均含量为0.02μg/kg,低于欧盟限量值（0.05μg/kg）；5）各时间点AFB1转化为AFM1的最大平均转化率为0.19%,出现在4 h；6）饲喂AFB1后24 h内的AFM1平均转化率之和占AFM1总转化率的81%。结果提示,AFM1在奶山羊乳中的排出时间主要集中在采食AFB1后的24 h内。

抗黄曲霉毒素M1纳米抗体的筛选与初步鉴定

黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)对人类和动物具有致癌性、诱变性、致畸性等,广泛存在于哺乳动物乳汁及其乳制品中。因此,制备特异性强、灵敏度高的抗体来检测AFM1至关重要。该研究以AFM1-BSA为抗原免疫双峰驼,采血分离淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,通过巢式PCR获得重链可变区(variable domain of heavy chain,VHH),与pComb3XSS载体连接电击转化至Escherichia coli TG1,构建AFM1特异性噬菌体展示文库。以AFM1-OVA为靶向抗原,使用4轮酸洗脱和竞争洗脱相结合的策略对文库进行淘选,并对抗AFM1纳米抗体进行初步鉴定,最后预测了精准的三维模型结构。结果显示,抗AFM1纳米抗体文库库容量为2.27×10^(9)CFU,多样性丰富,插入率为100%。经淘选共获得6条独特序列的纳米抗体。其中VHH-M4和VHH-M6具有较高的灵敏度,初步测定半抑制浓度分别为0.415 ng/mL和1.877 ng/mL,线性范围分别为0.141~1.652 ng/mL和0.800~3.811 ng/mL。一级和二级结构结果显示VHH-M4和VHH-M6均为亲水性蛋白,框架区(framework region,FR)和互补决定区(complementarity determining region,CDR)区符合典型纳米抗体的结构特征。该研究为AFM1免疫学检测提供核心元件,并为探究AFM1与VHH的分子结合机制奠定基础。

基于纳米抗体建立icELISA检测乳制品中黄曲霉毒素M1

纳米抗体(nanobody,Nb)具有稳定性高、特异性强、易于表达等优势,已经成为小分子免疫分析的重要工具。为了监测乳制品中黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)的污染情况,以先前从双峰驼AFM1免疫文库中淘选得到的抗AFM1型纳米抗体M6为研究对象,评估其理化性质并建立间接竞争酶联免疫吸附测定法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)。优化反应体系中封闭方法、甲醇溶液、pH值和离子强度等参数后,建立竞争抑制标准曲线,并进行方法学验证特异性和准确性。结果表明,Nb-M6具有良好的亲和力和热稳定性;Nb-icELISA的检测限(limit of detection,LOD)为0.111 ng/mL,半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为1.498 ng/mL,乳制品加标回收率为89.8%~104.1%,与高效液相色谱法的检测结果趋于一致。该方法操作简单、便捷,可应用于乳制品中AFM1的初步批量筛查。

酶联免疫吸附和胶体金技术对黄曲霉毒素M1检测的结合验证

[目的]为准确完成生牛乳中黄曲霉毒素M1检测。[方法]对比分析酶标仪、胶体金读数仪检测生牛乳中黄曲霉毒素M1的处理过程和检测数据。[结果]发现2种方法检验操作过程各有优劣,检测结果能满足不同需求。酶标仪可用于半定量检测,并进行精准检测和半定量复核。胶体金读数仪适合快速定性筛查。[结论]2种方法可配合使用,相互补充,灵活运用设备优势,高效完成检测需求。

快速检测乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的方法研究

黄曲霉毒素M1(AFM1)作为黄曲霉毒素的一种代谢产物,主要存在于生鲜乳及各种乳制品中。它属于二氢呋喃杂萘邻酮衍生物,呈无色结晶性粉末状,有绿蓝色荧光,物理化学性质稳定,具有很强的致癌性,且当乳品经过高温消毒后仍无法完全去除该毒素[1]。建立乳制品中黄曲霉毒素M1的高灵敏度、快速检测技术,对保障乳制品质量安全及消费者健康具有重大意义。

集成免疫磁珠富集和免疫层析的黄曲霉毒素M_1快速检测法

以喷涂了检测抗原黄曲霉毒素M1-BSA和驴抗鼠二抗形成检测线和质控线的硝酸纤维膜制备免疫层析试纸条,采用EDC/NHS法制备偶联了抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的免疫磁珠。免疫磁珠与待检样本混合,经捕获、磁分离后,浓缩重悬液直接用免疫层析试纸条检测,首次建立了集浓缩样本与免疫层析于一体的黄曲霉毒素M1快速检测法。该方法用于检测原料乳中黄曲霉毒素M1,检出限为0.1μg/L,低于我国制定的黄曲霉毒素M1限量标准(0.5μg/L),与其它真菌毒素和原料乳中常检违法添加物无交叉反应,分析结果与酶联免疫吸附法(ELISA)结果一致。本方法适合现场快速检测原料乳中黄曲霉毒素M1。

在线固相萃取富集-高效液相色谱法快速测定牛奶中黄曲霉毒素M_1

目的:建立在线固相萃取富集-高效液相色谱法(On-line SPE-HPLC)测定牛奶中黄曲霉毒素M1。方法:固相萃取富集柱填料为SB-C18,上样溶剂和淋洗溶剂均为纯水,转移溶剂为乙腈-水(20:80,V/V),分析测定溶剂为乙腈-水(15:85,V/V)。结果:黄曲霉毒素M1检测的线性方程为Y=2.52746X 0.067,相关系数为0.99906;检出限为0.04μg/kg;定量限为0.10μg/kg;基质4个水平添加回收率(n=6)在98%～105.7%;6次加标回收相对标准偏差在0.79%～2.56%。结论:此方法简便、准确、重现性好,能够满足对日常牛奶中黄曲霉毒素M1的定量检测。

我国饲料中黄曲霉毒素B_1污染的分布规律研究

采用酶联免疫(ELISA)法测定全国11个省份共计1013份饲料样品中黄曲霉毒素B1含量,了解我国饲料中黄曲霉毒素B1污染情况及分布规律。结果表明,饲料中黄曲霉毒素B1检出率高达99.51%,但超标率较低,平均为2.27%;不同省份饲料中黄曲霉毒素B1含量差异极显著(P<0.01),贵州省最高,河南省、四川省较高,福建省最低,其余7省居中;黄曲霉毒素B1含量由高到低依次为棉粕、家禽配合饲料、菜粕、玉米、仔猪配合饲料、麦麸、豆粕、鱼粉和小麦。我国饲料普遍受到黄曲霉毒素B1的污染,但饲料原料中黄曲霉毒素B1的超标率低,含量在不同区域和饲料种类间存在差异。

乳品中黄曲霉毒素M_1检测方法研究进展

黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后的代谢产物,主要分布在动物的乳汁、尿液中。黄曲霉毒素M1毒性很大,经乳制品摄入会对人体产生巨大的危害。本文主要对乳品中黄曲霉毒素M1毒性、危害、检测方法进行综述。对主要检测方法的特性及适用范围进行分析与概括,并且对未来黄曲霉毒素M1的检测方法的发展进行了合理展望。

抗黄曲霉毒素M_1抗体制备及检测方法建立

目的制备针对黄曲霉毒素M1的单克隆抗体并建立针对黄曲霉毒素M1的间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。方法利用B细胞杂交瘤技术。建立能分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，建立间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。结果研制出1株能特异性分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F2。该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1，亲和常数为2．8×10^-11mol／L。该抗体与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素M2等结构类似物有微弱的交叉反应，具有较高的特异性。在此基础上建立了间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。该方法的最低检出浓度为0．07ng／ml。校正曲线的线性范围为0．02～2ng／ml，线性方程y=-0．4364x＋0．2693（R^2=0．9949）。方法的加标回收率为72．5％～131．3％。结论制备了具有高特异性和亲和力的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，并建立了快速、灵敏的针对黄曲霉毒素M1的酶联免疫吸附试验检测方法。

黄曲霉毒素M_1的危害、污染现状及检测方法进展

本文针对黄曲霉毒素M1 的理化特性、危害、产生及防治进行了总结 ,详细介绍了黄曲霉毒素M1 的四类检测方法 ,并进行了比较 。

黄曲霉毒素M1免疫学检测方法研究进展

黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）是黄曲霉毒素的一种,是在动物摄入含有黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）的饲料后,AFB1在体内经羟基化所形成的代谢物。AFM1主要存在于动物的乳汁中,在肝肾、肉、蛋以及尿液也有存在。随着人们生活水平的提高,乳及乳制品以其较高的营养价值深受消费者的喜爱。

多功能柱净化液相色谱–质谱–质谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M_1

建立了简单、快速测定牛奶中黄曲霉毒素M1的液相色谱–质谱–质谱确证方法。样品经乙腈/水溶液(V/V,86/14)提取,226多功能柱净化,离心、吹干、定容和过滤,高压液相Xtera色谱柱(150 mm×2.1 mm×5μm)分离,选用0.1%甲酸溶液和乙腈/甲醇(V/V,50/50)作为流动相,采用外标法定量。结果经方法学研究验证,LOD=0.15 ng/mL,LOQ=0.5 ng/mL,线性相关系数R=0.9961;两种浓度加标回收率为71.5%和83.5%,相对标准偏差为2.7%和8.4%。该方法具有预处理简单、检测速度快、灵敏度高的优点,可适用于牛奶中黄曲霉毒素M1的确认和准确定量检测。

抗黄曲霉毒素M_1的单克隆抗体细胞株的建立

本研究建立了抗黄曲霉毒素AFM1 的单克隆抗体细胞株。用AFM1-肟-牛血清白蛋白(AFM1 -oxim e-BSA)偶联物免疫Ba1b/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经3～4次亚克隆建立了3个稳定分泌抗黄曲霉毒素M1 抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3G2,3G3,6G8。3株抗体均属IgG1 亚类。培养上清液的稀释度为1v2 000～1v12 800,腹水的抗体稀释度为1v3.2×106 ～1v20×107,参考工作稀释度为1v1×106 ～1v2.5×106。3G3和6G8抗体的IgG 含量分别为0.8和1.43 g/L,亲和常数分别为5.438和4.369。

超高效液相色谱-大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素M_1

采用超高效液相色谱系统,并配有大体积流通池的荧光检测器快速检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素M1.在样品中按m(牛奶)∶V(乙腈)=1∶2.5的比例加入乙腈,采用涡旋及超声辅助液液萃取法对样品中的黄曲霉毒素M1进行提取,经离心后,取上清液用磷酸盐缓冲液稀释,过黄曲霉毒素M1免疫亲和柱进行净化及浓缩;采用V(甲醇)∶V(乙腈)=50∶50及纯水作为流动相,经UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm)分离.结果表明:该方法的定量限为0.03μg/kg,低于现行食品安全国家标准对食品中黄曲霉毒素M1的最低限量标准,符合检测要求;同时,在0.06～1.2μg/kg范围内具有良好的线性,其线性相关系数大于0.999;3个加标浓度的回收率在81.95%～94.20%之间,效果较好;采用大体积流通池检测的灵敏度较普通流通池提高了近3倍;经用于奶及其制品中黄曲霉毒素M1的检测结果与现行标准方法一致;另外,在前处理中,用乙腈对样品中的黄曲霉毒素M1进行提取,可以有效地沉淀样品中的蛋白质,从而得到澄清的提取液,在过免疫亲和柱净化时只需利用溶液自身重力作用即能过柱.综上,此定量方法具有样品前处理简单、检测速度快和灵敏度高等优点,适用于对牛奶中黄曲霉毒素M1的检测.

基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器检测牛奶中黄曲霉毒素M_1

根据荧光共振能量转移原理,利用磁性纳米材料的磁性分离技术及荧光猝灭能力,构建了基于磁性纳米材料和适配体的荧光传感器,用于高灵敏检测牛奶中黄曲霉毒素M_1(aflatoxin M_1, AFM_1)。标记羧基荧光素(carboxy-fluorescein, FAM)的适配体通过静电作用吸附在Fe_3O_4磁性纳米颗粒表面,并与Fe_3O_4发生能量共振转移,导致荧光猝灭;当体系中存在AFM_1时,适配体与AFM_1特异性识别并形成折叠结构,适配体从Fe_3O_4磁性纳米颗粒表面脱附,使得荧光信号恢复,据此可实现对FAM_1的定量检测。该研究对所制备的Fe_3O_4磁性纳米颗粒进行表征,透射电镜结果表明,Fe_3O_4磁性纳米颗粒粒径在10～15 nm。在优化的实验条件下,该传感器的线性范围为0.05～0.70μg/L,检测限为0.02μg/L。利用荧光传感器检测牛奶中AFM_1的回收率为82.5%～102.3%。

SNAP快速检测法与高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M_1的比较分析

用SNAP快速检测法与高效液相色谱法对牛奶样品中黄曲霉毒素M1的检测,首先运用SNAP快速法对牛奶样品中的黄曲霉毒素M1进行初筛,其中的阳性样品通过免疫亲和层析柱净化,并用带荧光检测器的高效液相色谱仪进行定性定量检测,从而比较SNAP快速法与高效液相色谱法之间的差异性及相关性。通过比较,SNAP快速法虽然简单、快捷,但检测结果有假阳性现象;液相色谱法前处理、分析过程较复杂,但灵敏度高,检测限低,回收率及线性关系好,结果准确可靠。

三元超分子荧光增敏快速检测黄曲霉毒素M_1

根据黄曲霉毒素M_1(aflatoxin M_1,AFM_1)的荧光特性,研究β-环糊精(β-cyclodextrin,β-CD)及其衍生物(β-CDs)、金属盐(Hg^(2+))与AFM1形成的三元超分子体系及对AFM1荧光增强作用,并探索超分子包合物形成的机理。甲基-β-CD-Hg^(2+)-AFM_1三元体系中,当溶剂组成为体积分数20%甲醇溶液,Hg^(2+)、M-β-CD与AFM_1物质的量比分别为6.6×10~4∶1、5.80×10~5∶1时,荧光增强倍数可达到4.5倍。光谱法、热力学方法表明AFM1能进入M-β-CD空腔,从而减少荧光淬灭,增强荧光检测的灵敏度。利用Benesi-Hildebrand双倒数法和Van’t Hoff热力学方程研究超分子体系的包合常数与热力学常数,初步探讨超分子反应机理。该荧光增敏技术检测AFM_1,在0.01~2.00μg/L范围内分析线性良好,相关系数R^2为0.999 2,检出限为0.0026μg/L。这种衍生方法具有灵敏、简单、高效、经济等优点,乳品中除铁元素以外的大多数强化微量元素对测定无干扰作用,可应用于奶制品中AFM1的快速检测。

亲水亲脂平衡柱萃取高效液相色谱法快速测定干酪中的黄曲霉毒素M_1

研究了利用RP-HPLC对干酪中黄曲霉毒素M1进行测定,分别采用乙腈、甲醇、丙酮作为提取溶剂对干酪样品中的黄曲霉毒素M1进行提取,利用一种亲水亲脂平衡柱萃取黄曲霉毒素M1,然后上机检测,采用质量分数为25%的乙腈水溶液为流动相,流速1mL/min,利用荧光检测器进行检测。结果表明,采用乙腈作为干酪中黄曲霉毒素M1的提取试剂比其他2种溶剂更为适宜;OASIS HLB固相萃取净化柱对于黄曲霉毒素M1的分离纯化效果很好;干酪中的黄曲霉毒素在8min内被快速检出,平均回收率较高,相对标准偏差（RSD）为1.4%-5.7%,最低检出限为0.037μg/kg。该方法是一种针对干酪中黄曲霉毒素M1的快速高效的检测方法。